缺氧后適應與心肌營養(yǎng)素-1對心肌細胞缺氧復氧的保護作用及其機制.pdf

1、研究背景與目的:隨著生活水平的提高，心肌梗死發(fā)生率呈逐年上升的趨勢，經過不斷的探索，心肌梗死的死亡率已明顯下降，尤其是冠脈介入的廣泛開展以后，但卻引起了缺血再灌注損傷如心肌細胞死亡、血流動力學障礙、再灌注心律失常及內皮功能障礙等發(fā)生率的增加。
　　 心肌細胞遭受缺血再灌注損傷后將發(fā)生一系列病理改變，出現(xiàn)細胞代謝紊亂和功能障礙。首先，心肌細胞鈉鉀ATP酶受損，鈉離子在細胞內積聚，由于滲透壓的作用導致細胞外液向細胞內轉移，發(fā)生細胞水

2、腫、腫脹。病變進展將逐漸出現(xiàn)細胞超微結構的改變，細胞膜及細胞器膜的完整性遭到破壞，由可逆性損傷向不可逆損傷轉化。心肌細胞受到缺血再灌注損傷的同時，微血管內皮細胞同樣受到損傷，擴血管物質減少縮血管物質增加，血小板及白細胞吸附于血管壁導致微血管阻塞，出現(xiàn)微血管水平無灌注現(xiàn)象。
　　 根據(jù)已有的研究，目前認為缺血再灌注損傷的主要機制為細胞內產生過多的自由基和細胞內鈣超載。心肌細胞缺血時，線粒體氧化磷酸化功能障礙，使得線粒體氧化磷酸化途

3、徑減弱而生成氧自由基過程加強，同時氧自由基清除劑又因缺氧而活性降低，最終產生大量活性氧自由基。除此之外，中性粒細胞的“呼吸爆炸”及經黃嘌呤氧化酶催化亦可產生氧自由基。氧自由基具有活潑的反應性，能夠與膜磷脂、蛋白質、核酸等物質發(fā)生反應，導致細胞損傷。細胞缺氧導致各種離子轉運泵功能障礙，細胞膜通透性增加，鈣離子在細胞內聚集，細胞內鈣濃度明顯增加后可激活鈣依賴蛋白酶、蛋白水解酶、磷脂酶等酶類，并可沉積于線粒體，加重細胞損傷。
　　 缺

4、血后適應，即在心肌缺血再灌注的即刻對冠脈進行短暫、重復的開通及再閉過程，隨后恢復冠狀動脈血流[1]。研究表明，缺血后適應可保護缺血再灌注損傷的心肌，在提高心肌細胞存活率、減少心肌細胞凋亡、降低心肌梗死面積[2-3]和改善內皮細胞功能等方面起到一定的保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，缺血后適應可保護血管內皮細胞穩(wěn)定、抑制再灌注心肌細胞氧自由基的產生、減少中性粒細胞的激活及聚集，減少微血管的病變，影響缺血再灌注損傷的各個環(huán)節(jié)，減少心肌細胞損傷。缺血

5、后適應主要應用在急性心肌梗死的PCI治療中，操作方法簡便，在臨床應用以來，表現(xiàn)出了較好的臨床效果。Garcia等[4]發(fā)現(xiàn)經過后適應治療能夠明顯降低心肌梗死后CK的峰值及CK-MB的比例，減少患者心肌梗死面積。缺血后適應在基礎及臨床都顯示出較好的心肌保護作用，臨床證實具有一定的可行性、安全性及潛在作用。
　　 心肌營養(yǎng)素-1(Cardiotrophin-1，CT-1)是由Pennica[18]在1995年從小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)液中

6、分離出來的，被分類于白介素-6(IL-6)及白血病抑制因子(LIF)細胞因子家族，化學結構與白介素-6家族相似并且可以與gp130受體結合。在早期，CT-1只是作為心肌疾病診斷和判斷預后的標志物，最近的研究發(fā)現(xiàn)在心肌損傷中它是一種重要的神經激素，主要表達于心肌細胞和心肌成纖維細胞，骨骼肌、肝臟和神經節(jié)等多種分化組織中亦有表達，可參與心臟生理調節(jié)過程，具有促進細胞存活和心臟正常發(fā)育的作用。在大鼠的動物實驗中，心室肥厚的早期階段即出現(xiàn)CT-

7、1 mRNA表達增加，而且心肌肥厚后CT-1一直保持高水平表達[5]。López B[6]等通過研究發(fā)現(xiàn)，血漿CT-1水平與心力衰竭程度、左心室質量指數(shù)呈正相關，與射血分數(shù)呈負相關，而且這些相關性獨立于很多錯綜復雜的潛在影響因素，提示CT-1可作為評估心衰程度的指標，進一步的研究表明CT-1較N末端腦鈉肽原對C期心力衰竭患者的診斷靈敏度更高，測量血漿CT-1濃度可對C期心力衰竭患者提供額外的信息。
　　 以上的研究表明CT-1與

8、心室重構密切相關，而Jin[7]等發(fā)現(xiàn)CT-1還對血流動力學有一定影響。靜脈注射CT-1后大鼠會發(fā)生全身性低血壓，其機制為降低外周血管阻力，并且這種降血壓效應呈劑量依賴性;CT-1降壓的同時可增加心排血量，改善心功能。實驗已經證明，CT-1在心肌梗死后的缺血心肌中表達明顯增加，提示CT-1具有抗心肌細胞死亡，促進殘存心肌細胞存活及加快梗死區(qū)愈合的作用?；A研究發(fā)現(xiàn)CT-1能促進新生大鼠心肌細胞在無血清培養(yǎng)基中存活，以上均表明CT-1對心

9、肌細胞缺血缺氧具有保護作用。
　　 心肌細胞遭受再灌注損傷后，線粒體通透性轉換通道（mitochondriaipermeabiiity transition pore，mPTP）通透性增高，促凋亡蛋白由線粒體釋放到細胞漿中[8]，導致細胞死亡一一凋亡或壞死[9]。后適應可激活ERK1/2通路，使其下游的GSK-3β磷酸化而失去活性，提示ERK1/2信號通路的激活可抑制mPTP的開放，減少細胞凋亡及壞死。ERK1/2信號通路的激活

10、還可抑制BAD活性或促進蛋白轉錄而發(fā)揮保護作用[10]。CT-1具有心肌保護作用，但其具體的作用機制以及信號轉導途徑尚需進一步的研究來證實。
　　 本研究以H9C2心肌細胞株為實驗對象，在離體情況下，以缺氧復氧模型模擬缺血再灌注損傷，以缺氧后適應模型模擬缺血后適應，將缺氧后適應與CT-1兩種細胞保護措施聯(lián)合，通過觀察心肌細胞存活率、凋亡率、Bad mRNA表達量及磷酸化ERK1/2蛋白（p-ERK1/2蛋白）表達的變化，了解在缺

11、氧后適應的基礎上聯(lián)合CT-1后對缺氧復氧心肌細胞的保護作用。并應用信號通路阻斷劑，阻斷信號傳導，進一步闡明CT-1和缺氧后適應對缺氧復氧心肌保護作用的機制及信號轉導途徑，從微觀水平論述CT-1和缺氧后適應如何通過信號通路激活保護心肌細胞免受缺氧復氧損傷。
　　 材料:離體培養(yǎng)H9C2心肌細胞株，H9C2心肌細胞株在含10％胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基和37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，復蘇細胞正常傳2、3代后，取指數(shù)生長期

12、的細胞進行實驗。
　　 方法:將細胞分為6組，分別給予不同的處理。a.正常對照組:細胞用含10％新生牛血清的DMEM液正常培養(yǎng)，不經任何處理。b.缺氧復氧組:缺氧，用pH6.8 D-Hanks液在缺氧培養(yǎng)箱(95％N2，5％CO2，37℃)培養(yǎng)3h;復氧，缺氧3h之后用把pH6.8 D-Hanks換成含10％新生牛血清DMEM液，在MCO-17AICO2培養(yǎng)箱(95％O2，5％CO2，37℃)復氧3h。c.缺氧復氧+缺氧后適應組

13、:同(2)組，在復氧之前施加5 min復氧/5 min缺氧3個循環(huán)。d.缺氧復氧+缺氧后適應+CT-1組:同缺氧復氧組，在缺氧3h后加入10ug/l心肌營養(yǎng)素-1，再施加5min復氧/5min缺氧3個循環(huán)，復氧3h。e.缺氧復氧+缺氧后適應+CT-1+ERK抑制劑組:在缺氧完成前30min加入20umo1/l ERK抑制劑A6355，缺氧完成后加入10ug/l心肌營養(yǎng)素-1，再施加5min復氧/5min缺氧3個循環(huán)，復氧3h。f.缺氧復

14、氧+缺氧后適應+CT-1+二甲基亞砜組:ERK抑制劑換為二甲基亞砜，其他同(e)。應用MTS法檢測各組細胞存活率，以流式細胞儀檢測及細胞凋亡率，采用Western Blot檢測細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK1/2和p-ERK1/2）的表達，Q-PCR技術檢測Bad mRNA的表達。
　　 結果:與對照組相比，缺氧復氧組、缺氧復氧+缺氧后適應組、缺氧復氧+缺氧后適應+CT-1組、缺氧復氧+缺氧后適應+CT-1+ERK抑制劑組、缺氧復氧

15、+缺氧后適應+CT-1+二甲基亞砜組的細胞存活率下降、凋亡率升高、BadmRNA表達量增加，P＜0.05，差異均有統(tǒng)計學意義。經過缺氧后適應處理后，較缺氧復氧組細胞存活率上升、凋亡率下降、p-ERK1/2蛋白表達量增加、Bad mRNA表達量減少，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。在缺氧后適應處理基礎上加入心肌營養(yǎng)素-1(CT-1)后，細胞存活率上升、凋亡率下降、p-ERK1/2蛋白表達量增加、Bad mRNA表達量減少，P＜0.05，

16、差異具有統(tǒng)計學意義。在缺氧復氧+缺氧后適應+CT-1組中加入ERK抑制劑后，細胞存活率下降、凋亡率升高、p-ERK1/2蛋白表達量減少、Bad mRNA表達量增加，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。由于ERK抑制劑由二甲基亞砜溶解，而二甲基亞砜本身具有一定細胞毒性，將ERK抑制劑換為二甲基亞砜，與缺氧復氧+缺氧后適應+CT-1組相比，細胞存活率、凋亡率、p-ERK1/2蛋白表達量、Bad mRNA表達量無明顯變化，P＞0.05。各組細胞