血清microRNA作為生物標記物在結直腸腺癌早期診斷中的應用.pdf

1、結直腸癌(colo rectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國，結直腸癌死亡率居惡性腫瘤第五位，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。結直腸癌大多經歷了正常粘膜—腺瘤—腺癌的發(fā)展過程，即Nornal-Adenoma-Adenocarcinoma(N-A-AC)學說。腺癌是結直腸癌最主要的組織學類型，而腺瘤被公認為結直腸腺癌最重要的癌前病變。結直腸腺癌早期不易發(fā)現，大多患者就診時已到中晚期，盡管診療技術不斷發(fā)展，患者

2、術后5年生存率并無明顯改善，缺乏有效的診斷方法實現對結直腸腺癌及其癌前病變的早期診治是主要的原因之一，若能早期發(fā)現并切除結直腸腺癌及其腺瘤病變，將有助于降低其發(fā)病率及死亡率。目前，臨床上結直腸腺癌早期診斷主要依賴于腸鏡、影像學檢查和血清學標志物癌胚抗原（Carcinoembryonicantigen，CEA）等，因具有侵入性或敏感性、特異性不足，而無法滿足臨床需求。尋找敏感性、特異性高的生物標志物用于結直腸腺癌早期診斷仍是臨床亟待解決的

3、難題。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長度約19-24個核苷酸的非編碼小分子RNA，其異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。近年研究發(fā)現，血液中存在豐富而穩(wěn)定的miRNA，其表達譜具有明顯的組織特異性，在不同腫瘤中具有特異的表達譜，是具有潛在價值的腫瘤早期診斷生物標志物。單一miRNA作為標志物的敏感性和特異性仍難以滿足臨床需求，將差異miRNA組合建立腫瘤特異性表達譜將改進單一分子標志物難以克服的低靈敏度、低特異性問題，

4、成為早期診斷的有效手段。若能獲得結直腸癌血清miRNA表達譜，可為其早期診斷提供一條新途徑。
　　在miRNA表達研究中，很多因素（如RNA的數量和濃度）可導致樣品測定結果出現偏差。目前，RT-qPCR是miRNA定量檢測最常用的方法，選用恰當的內參基因是RT-qPCR定量檢測數據標準化最常用的方法，在miRNA研究中發(fā)揮重要作用。對于結直腸腺癌、腺瘤外周血miRNART-qPCR定量檢測，目前尚無適宜內參基因篩選的相關研究報道。

5、
　　基于上述問題，本課題采用高通量Miseq測序技術，對結直腸腺癌、腺瘤和健康對照組的血清miRNA進行了系統(tǒng)分析，確定標準篩選三組間無差異表達的miRNA和三組間漸進性升高或降低的差異表達miRNA，對上述無差異表達的miRNA進一步RT-qPCR驗證，并經geNorm、Normfinder軟件評估，篩選用于結直腸腺癌血清miRNART-qPCR測定的最適合內參，為下一步結直腸腺癌血清miRNA差異表達檢測及數據標準化分析提供

6、了保障;以篩選出的內參基因作為內對照，將上述差異表達的miRNA進行逐個RT-qPCR驗證，篩選差異有統(tǒng)計學意義的miRNA，運用ROC曲線評估各差異miRNA的診斷價值;采用多元logistic回歸分析方法將差異miRNA引入回歸方程，建立logit(P)判別公式，構建miRNApanel;同時，對miRNApanel采用盲法分析，進行大樣本臨床驗證，評估其在結直腸腺癌診斷及鑒別診斷中的應用價值。
　　第一部分：結直腸腺癌血清m

7、icroRNART-qPCR檢測最適內參基因的選擇與驗證
　　研究目的：
　　實時熒光定量PCR(RT-qPCR)是目前血清microRNA(miRNA)最常用的檢測方法，內參基因的選擇對獲得可靠RT-qPCR分析數據至關重要。本研究旨在對結直腸腺癌患者血清miRNA定量PCR檢測中的內參基因進行系統(tǒng)評估與驗證，篩選最適內參基因。
　　方法：
　　收集30例結直腸腺癌、25例結直腸腺瘤和30例健康對照血清，采用高

8、通量Miseq測序技術對三組混合樣本進行測序，選擇在三組樣本中表達無差異的miRNA作為候選內參基因;采用RT-qPCR技術在45例結直腸腺癌、40例結直腸腺瘤和40例健康對照血清中對篩選出的候選內參基因和常用內參基因U6snRNA進行驗證;利用geNorm和NormFinder兩種運算法則評估內參基因的表達穩(wěn)定性，進一步選擇最適內參基因;在60例結直腸腺癌、60例結直腸腺瘤和60例健康對照血清中對篩選出的最優(yōu)內參基因進行驗證，并采用篩

9、選出的內參基因評估m(xù)iR-92a-3p在結直腸腺癌患者血清中的表達。
　　結果：
　　1.候選內參基因的測序篩選:結直腸腺癌組與腺瘤組、結直腸腺癌組與健康對照組、腺瘤組與健康對照組兩兩比較發(fā)現，拷貝數大于50且兩組間表達無差異的miRNA分別為17個、32個和25個。進一步分析，得到三組間表達均無差異的miRNA共13個，作為候選內參基因。
　　2.候選內參基因的RT-qPCR驗證:上述候選內參基因中，有5個miRNA

10、(miR-151a-3p,miR-4446-3p,miR-221-3p,miR-93-5p和miR-3184-3p)在音分標本中無法檢測到;miR-197-3p和miR-26a-5p的平均Cq值大于35;miR-103b,miR-484,miR-16-5p,miR-3615,miR-18a-3p,miR-191-5p和U6snRNA均可在所有標本中檢測到且平均Cq值小于35。
　　3.所選內參基因表達穩(wěn)定性評估:采用geNorm和

11、NormFinder兩個運算軟件評估上述7個內參基因的穩(wěn)定性，GeNorm分析結果顯示miR-191-5p，miR-16-5p，U6snRNA和miR-18a-3p可作為內參基因;geNorm和NormFinder均顯示miR-191-5p是表達最穩(wěn)定的內參基因，miR-191-5p和U6snRNA組合是最穩(wěn)定的內參基因組合。
　　4.最適內參基因的驗證:在另一獨立大樣本中進行驗證，結果顯示miR-191-5p，U6snRNA和m

12、iR-191-5p+U6snRNA組合在結直腸腺癌、腺瘤和健康對照組中表達均無統(tǒng)計學差異，在結直腸腺癌的不同分期患者中表達也無統(tǒng)計學差異。
　　5.MiR-92a-3p分子的表達:采用miR-191-5p+U6snRNA組合作為內參，檢測血清miR-92a-3p分子在不同組的表達。結果顯示，miR-92a-3p在結直腸腺癌患者中表達高于腺瘤和健康對照組(P＜0.001)，在腺瘤患者中的表達高于健康對照(P＜0.001)。MiR-9

13、2a-3p的表達隨結直腸癌患者TNM分期的進展而升高，血清miR-92a-3p表達在結直腸腺癌患者Ⅰ期與Ⅲ/Ⅳ期，Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期，Ⅲ期與Ⅳ期差異均有統(tǒng)計學意義，而在Ⅰ期與Ⅱ期差異無統(tǒng)計學意義（P=0.66）。
　　結論：
　　MiR-191-5p和U6snRNA的組合可作為結直腸腺癌、結直腸腺瘤和健康對照血清中miRNART-qPCR檢測的最適宜內參基因。
　　第二部分：結直腸腺癌血清microRNApanel的建立及

14、臨床應用
　　研究目的：
　　結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，目前用于其早期診斷的方法或具侵入性、或敏感性特異性不足尚無法滿足臨床需求。血清中存在豐富而穩(wěn)定的miRNA，其作為標志物為腫瘤早期診斷提供了一條新途徑。本研究旨在篩選結直腸腺癌差異表達miRNA，進而構建miRNApanel用于結直腸腺癌的早期診斷。
　　方法：
　　收集30例結直腸腺癌、25例結直腸腺瘤和30例健康對照血清，采用高通量Miseq測

15、序技術對三組混合樣本進行測序，篩選結直腸腺癌差異表達miRNA，作為候選標志物。采用RT-qPCR技術對上述差異miRNA驗證，進一步篩選差異有統(tǒng)計學意義的miRNA，將差異miRNA引入多元logistic回歸分析，建立miRNApanel，采用ROC曲線評估該miRNApanel的診斷價值。
　　結果：
　　1.候選標志物的篩選:測序結果顯示:結直腸腺癌、腺瘤和健康對照組血清中拷貝數大于10的miRNA分別為348，30

16、3和283個。根據確定的篩選標準，miR-195-5p,miR-92a-3p,miR-1290,miR-582-5p,miR-223-3p,miR-136-5p,miR-3074-5p,miR-29a-3p,miR-221-3p,miR-148a-3p,miR-19a-3p和miR-17-3p在健康對照組、腺瘤和結直腸腺癌組呈漸進性高表達，而miR-422a，miR-1260a和miR-4502呈漸進性低表達。
　　2.差異miR

17、NA的RT-qPCR驗證:將上述15個差異表達miRNA在80個獨立樣本中進行RT-qPCR驗證，結果顯示miR-19a-3p，miR-223-3p和miR-92a-3p在結直腸腺癌組表達高于腺瘤和對照，腺瘤組表達高于健康對照;miR-422a則呈漸進性低表達。進一步在240個樣本中檢測，ROC曲線評估m(xù)iR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p和miR-422a診斷結直腸腺癌的AUC分別為0.849，0.871，0

18、.890和0.843。
　　3.miRNAspanel的建立:將miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p和miR-422a引入多元logistic回歸分析，得到結直腸腺癌的判別公式為:logit(P)=0.3313-0.0081*miR-19a-3p-0.0257*miR-92a-3p-0.0406*miR-223-3p+0.1328*miR-422a，該4-miRNApanel診斷結直腸腺癌的AUC為0.

19、960。
　　4.miRNAspanel診斷價值驗證:進一步在獨立樣本中驗證發(fā)現，4-miRNApanel診斷結直腸腺癌的AUC為0.951(95％CI:0.907-0.978;敏感性和特異性分別為84.3％和91.6％)，高于傳統(tǒng)標志物CEA(AUC:0.667，95％CI:0.593-0.735，P＜0.001);在CEA陽性組(＞5ng/mL)，其診斷AUC為0.918(95％CI:0.861-0.957;敏感性和特異性分別

20、為76.79％和85.56％);CEA陰性組（＜5ng/mL），其診斷AUC為0.810(95％CI:0.725-0.818;敏感性和特異性分別為57.14％和86.67％);該4-miRNApanel診斷結直腸腺癌TNMⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ患者的AUC分別為0.942，0.935，0.954和0.983;同時我們還分析了該4-miRNApanel對腺瘤的診斷和鑒別診斷價值，發(fā)現其鑒別診斷腺瘤和腺癌的AUC為0.886，區(qū)分腺瘤和健康對照的A