轉錄因子Phox2對去甲腎上腺素能神經元表型的調控研究.pdf

1、近年來，病毒載體已經成功地用于介導基因或小分子干擾RNA進入哺乳動物神經元或腦。然而，這個途徑的缺點是病毒載體的表達會隨時間而消退，表達的高峰出現(xiàn)在2-3天，7天后就消失了。如何將基因高效轉染及長期穩(wěn)定表達成為人們研究的熱點。近期研究者把目光投向了以I型人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficieney virus type1，HIVl)為代表的慢病毒，不僅具有可感染非分裂期的細胞、目的基因整合至靶細胞基因組以及長期表達、免疫反

2、應小等優(yōu)點，而且對重組包膜質粒、包裝質粒及重組目的基因穿梭質粒進行改造后，極大降低了其自我復制能力，使安全性大大提高，有望成為理想的基因載體。本研究采用RT-PCR方法獲得大鼠Phox2a和Phox2b全外顯子片段，將其克隆入慢病毒表達載體并進行序列測定，利用293FT包裝細胞制備了Phox2a/2b與增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)融合基因慢病毒。注射病毒濃縮液至大鼠

3、LC部位，介導Phox2a和Phox2b在LC長期穩(wěn)定表達，為研究Phox2a和Phox2b在去甲腎上腺素能系統(tǒng)中的作用及機制提供適合的穩(wěn)定轉染細胞的載體，為基因治療一些神經退化性疾病提供理論和實驗依據。
　　 本實驗分兩部分：一、用攜帶人類Phox2a/2b cDNA的pCMV6-XL5載體以及對人類Phox2a/2b基因特異的shRNA分別轉染SK-N-BE(2)C細胞，從過表達、封閉基因表達兩方面探索Phox2基因對分化成

4、熟的去甲腎上腺素能神經元細胞中NET和DBH表達的影響。二、克隆大鼠Phox2基因并構建能穩(wěn)定表達Phox2的慢病毒載體，通過慢病毒包裝體系生成能有效感染分裂細胞和非分裂細胞的重組慢病毒顆粒；注射此重組慢病毒至大鼠LC部位，一段時間后觀察Phox2基因的過表達對成年大鼠腦組織相關部位NET和DBH表達的影響。本研究首次探索轉錄因子（包括Phox2a/2b）和成熟的去甲腎上腺素能神經系統(tǒng)之間可能的關系，為深入了解帕金森氏病(Parkins

5、on's disease，PD)、老年癡呆癥(Alzheimer's disease，AD)及重癥抑郁(Major depression)等神經性疾病的發(fā)病機制提供了重要的理論和實驗依據；構建的高效持久的攜帶Phox2基因的慢病毒表達載體為這些神經性疾病的臨床治療提供新的途徑。
　　 第一部分轉錄因子phox2對SK-N-BE(2)C細胞中去甲腎上腺素傳遞體(NET)和多巴胺β-羥化酶(DBH)表達的影響
　　 目的：P

6、hox2a和Phox2b是兩個同源異型結構域蛋白，在胚胎形成過程中控制去甲腎上腺素能神經元的分化。NET和DBH是去甲腎上腺素能系統(tǒng)的兩個重要標志物。本研究檢測了Phox2a/2b在體外對NET和DBH表達的影響，從而了解Phox2基因對分化的去甲腎上腺素能神經元細胞的調控作用。
　　 方法：1．培養(yǎng)SK-N-BE(2)C細胞至90％匯合度時，分別用0.1、1、5μg攜帶人類Phox2a/2b cDNAs的pCMV6-XL5質粒

7、，由脂質體Lipofectamine2000介導轉染細胞，對照組則轉染pCMV6-XL5空載體。轉染后3～44天收集各組細胞，RT-PCR法檢測Phox2a或Phox2b、NET、DBH、TH等在mRNA水平的表達；Western Blot檢測各指標在蛋白水平的表達；NET的轉運功能以再攝取[3H]標記的去甲腎上腺素能力來判斷。2．SK-N-BE(2)C細胞培養(yǎng)至50-60％匯合度時，用Arrest-In轉染試劑將2μg對Phox2a或

8、Phox2b特異的shRNA質粒DNA轉染細胞，對照組按相同步驟轉染pLK0.1空載體。轉染5-7天后收集各組細胞，按與l相同的方法檢測各指標。3．為證明Phox2a或Phox2b是否單獨地調控甲腎上腺素能表型，將2μg對Phox2a(或Phox2b)特異的shRNA質粒與5μgPhox2b(或Phox2a)cDNA同時轉染SK-N-BE(2)C細胞，對照組則同時轉染pCMV6-XL5和pLK0.1空載體，3-4天后收集各組細胞測定DB

9、H在mRNA、蛋白質水平的表達變化。
　　 結果：0.1～5μg的Phox2a/2b cDNAs能明顯提高NET和DBH在mRNA及蛋白質水平的表達，且呈劑量相關性。轉染后NET表達的增加相應地表現(xiàn)出[3H]標記的去甲腎上腺素攝入的增加。和單獨轉染Phox2a或Phox2b相比，共轉染Phox2a和Phox2b并沒有表現(xiàn)出對NET和DBH表達的協(xié)同促進作用。轉染對Phox2a或Phox2b基因特異的shRNA后，通過關閉內源性P

10、hox2a/2b，顯著降低NET和DBH在mRNA及蛋白質水平的表達，同時伴隨著[3H]標記的去甲腎上腺素攝取的下降。而且，共轉染Phox2a和Phox2b基因特異的shRNAs后，其對NET的mRNA水平表達的影響具有累加效應。最后，轉染Phox2a基因特異的shRNA所引起的DBH表達的下降可以通過轉染Phox2b基因的cDNA來逆轉，反之亦然。證明Phox2a和Phox2b對SK-N-BE(2)C細胞中DBH表達水平影響的互換效應

11、。
　　 結論：該研究在體外證實了Phox2a和Phox2b對NET和DBH表達及生物學功能的調控作用，深入地闡明Phox2a/2b這兩個轉錄因子對去甲腎上腺素能系統(tǒng)中關鍵蛋白的調節(jié)作用，可能開辟了治療老年引起的去甲腎上腺素能系統(tǒng)功能失調的新途徑。
　　 第二部分攜帶EGFP和大鼠phox2融合基因重組慢病毒載體的構建及其對大鼠腦去甲腎上腺素能神經元的調控作用
　　 目的：克隆全長大鼠轉錄因子Phox2 cDNA

12、，制備大鼠Phox2基因與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)融合基因慢病毒，病毒體外感染293FT細胞和體內感染大鼠LC部位，以確定病毒攜帶的Phox2基因表達效率，探索Phox2基因的神經生物學功能。
　　 方法：采用RT-PCR方法獲得大鼠Phox2a/2b全外顯子片段，運用TOPO克隆技術使之克隆到慢病毒表達載體質粒pLenti6/V5-DEST中。經限制性醇切、PCR擴增和測序鑒定重組載體。在脂質體介導下將慢病毒包裝系統(tǒng)的包

13、裝結構基因pCMV△8.9、包膜基因VSVG和目的基因pLenti6/V5-EGFP-Phox2a/2b導入病毒包裝細胞293FT，熒光顯微鏡檢測基因的表達。包裝成病毒后，收集病毒上清，濃縮。未濃縮的病毒液稀釋到不同濃度梯度轉染HT1080細胞，殺稻瘟素（Blasticidine）篩選抗性細胞克隆，計數細胞克隆后確定病毒滴度。制備的病毒感染293FT細胞，3天后熒光顯微鏡檢測基因的表達，收集細胞以Western Blot法檢測Phox2

14、基因在蛋白質水平的表達。將大鼠分4組：對照組、假手術組、注射重組Phox2a病毒組和Phox2b組。濃縮的病毒(2～3μl，Ixlo8TU/ml)立體定位微量注射至大鼠LC部位，不同時間段(7d，14d，21d)取大鼠藍斑(LC)、海馬(hippocampus，HP)和嗅球(olfactory bulb，OB)等組織，通過原位雜交(In Situ Hybridization)、Western Blot、免疫組化(Immunohistoc

15、hemistry，IHC)、BrdU標記等方法檢測各組Phox2、NET、DBH、TH及神經元細胞增殖(Neurogenesis)等的變化。
　　 結果：限制性內切酶酶切和DNA測序分析證實RT-PCR獲得的大鼠Phox2a/2b cDNA片段與GenBank中公布的數據基本吻合：EGFP與大鼠Phox2a/2b融合基因準確克隆入pLenti6/V5-DEST的多克隆位點。慢病毒的3種質?？筛咝мD染入293FT細胞，熒光顯微鏡下

16、觀察可見大量的綠色熒光。未濃縮病毒液的滴度可達5xl06 TU/ml。病毒感染293FT細胞后Phox2基因在蛋白質水平的表達有明顯的增加。原位雜交結果顯示，注射重組Phox2a/2b病毒組在不同時間點，Phox2a和Phox2b在LC部位的mRNA水平均有顯著升高，注射后14天Phox2a增加最多，達146％;注射后7天Phox2b增加最多，達41％。與對照組及假手術組相比，Phox2a和Phox2b的過表達分別伴隨著NET和DBH

17、mRNA水平的明顯增加，NET分別增加了78.2％和110％，DBH分別增加了42.2％和39.3％；同樣，在HP部位，Western Blot結果顯示，和對照組及假手術組相比，Phox2a和Phox2b的過表達也分別伴隨著NET和DBH在蛋白質水平的明顯增加，NET分別增加了78.4％和48.6％，DBH分別增加了37.6％和32.3％；在OB部位也獲得相似的實驗結果；BrdU標記結果證明由Phox2a/2b導致的NET、DBH表達的

18、增加可以促進LC部位神經元細胞的增殖，尤其是聯(lián)合注射重組Phox2a和Phox2b病毒組對神經元細胞增殖的效應最明顯。
　　 結論：成功制備了大鼠Phox2與EGFP融合基因慢病毒，為研究Phox2基因在去甲腎上腺素能系統(tǒng)的發(fā)生分化等過程中的作用機制提供合適的穩(wěn)定轉染細胞的載體；體內外試驗證實上調Phox2的表達可促進成熟大鼠腦組織中NET和DBH的表達，預示了Phox2基因對維持大鼠出生后去甲腎上腺素能神經元的功能發(fā)揮著重要作