產(chǎn)黃曲霉毒素菌株的檢測方法及產(chǎn)毒條件的研究.pdf

1、黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有致癌、致畸、致細胞突變的“三致”作用，一直都受到各國的關注；其中寄生曲霉的所有菌株都能產(chǎn)生黃曲霉毒素而黃曲霉只有部分菌株能產(chǎn)生黃曲霉毒素；據(jù)FAO報道，全球每年約有25％的農(nóng)作物遭受霉菌及其毒素的污染，約有2％的農(nóng)作物因污染嚴重而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟價值。但國內(nèi)外研究的焦點主要集中在黃曲霉毒素的檢測方法，而對產(chǎn)黃曲霉毒素菌株檢測的方法報道較少；傳統(tǒng)的微生物檢測方法費時、費力而且容易出現(xiàn)

2、假陰性結果，給檢測帶來誤差。目前對于被黃曲霉毒素污染的糧食只是被動地采用減毒化處理，并沒有真正從產(chǎn)毒菌株這一源頭上進行有效防控，其主要原因在于對毒素產(chǎn)生菌的產(chǎn)毒機制、產(chǎn)毒條件和毒素積累規(guī)律缺乏深度了解，缺少可用于指導防控實踐的理論依據(jù)。 本文研究了3種不同的方法檢測產(chǎn)黃曲霉毒素的菌株，同時對產(chǎn)毒菌株的產(chǎn)毒條件和毒素積累規(guī)律進行了摸索，實驗模擬了糧食儲藏環(huán)境，確定產(chǎn)毒的最優(yōu)條件和最低條件，通過對黃曲霉產(chǎn)毒條件和毒素積累規(guī)律的研究不

3、僅可以確定影響毒素產(chǎn)量的主要環(huán)境因素，而且還可以預測出在自然環(huán)境中菌株的產(chǎn)毒情況，從而為揭示其產(chǎn)毒機制并進一步制定出相應的防控措施提供依據(jù)。主要研究結果如下： 1.在毒素提取方法上參考中華人民共和國國家標準并加以改進，確定了發(fā)酵液中黃曲霉毒素的提取方法，采用免疫親和柱法進行純化處理實現(xiàn)了黃曲霉毒素的有效分離并減少了其它毒素的干擾；再經(jīng)過柱后電化學衍生增大熒光強度進行熒光檢測，實現(xiàn)快速、準確檢測黃曲霉毒素；因此可以定性、定量的檢測

4、產(chǎn)黃曲霉毒素菌株。 2.利用環(huán)糊精可以增強黃曲霉毒素熒光強度這一特性，在普通霉菌培養(yǎng)基中添加β-環(huán)糊精和Mβ-環(huán)糊精，在本實驗條件下，通過對β-環(huán)糊精和Mβ-環(huán)糊精作用效果、添加濃度的比較，確定了Mβ-環(huán)糊精添加濃度為6g/L時對增強黃曲霉毒素熒光效果較好；同時，對Mβ-環(huán)糊精增強黃曲霉毒素熒光的特異性做了分析，結果表明Mβ-環(huán)糊精只能增強黃曲霉毒素的熒光性。該方法在普通霉菌培養(yǎng)基上都適用，這與傳統(tǒng)的檢測方法相比要簡單、快速，且

5、節(jié)省人力、物力。 3.通過對黃曲霉毒素合成過程中重要的幾個結構基因的篩選，發(fā)現(xiàn)aflO、aflD和aflP這三個基因是黃曲霉毒素合成過程中的關鍵基因，這三個基因同時表達的菌株經(jīng)HPLC檢測都是產(chǎn)黃曲霉毒素菌株，因此可以通過RT-PCR的方法檢測這三個基因是否同時表達可以推斷出該菌株是否是產(chǎn)毒菌株或其是否具有產(chǎn)毒的可能性。 4.通過正交試驗確定了產(chǎn)毒菌株的最適產(chǎn)毒條件和最低條件；實驗利用溫度、PH、轉(zhuǎn)速來模擬糧食的儲藏環(huán)境

6、，實驗表明，通過控制改變儲藏環(huán)境條件來控制產(chǎn)毒菌的產(chǎn)毒是一個高效易行的方法；儲藏環(huán)境中的通風條件，儲藏環(huán)境溫度和儲藏物的pH對菌株的產(chǎn)毒影響重大，較低的溫度和良好的通風，即一個涼爽干燥的儲藏環(huán)境，加上弱堿性的條件pH值可以很好的降低毒素的產(chǎn)量。 5.本文同時還對黃曲霉菌株和寄生曲霉菌株的毒素積累規(guī)律做了研究，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，黃曲霉毒素的產(chǎn)生量在短時間內(nèi)迅速增加；通過對黃曲霉產(chǎn)毒條件的研究不僅可以預測出在自然環(huán)境中菌株的產(chǎn)毒情況