廣州地區(qū)老年患者肺炎鏈球菌的耐藥性和分子流行病學(xué)研究.pdf

1、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是社區(qū)獲得性呼吸道感染的主要病原菌。老年人與普通成年人相比，社區(qū)獲得性呼吸道感染的總發(fā)生率、相關(guān)的發(fā)病率和死亡率都更高。目前，對(duì)青霉素或紅霉素耐藥的肺炎鏈球菌在全球廣泛流行。同時(shí)，多藥耐藥肺炎鏈球菌的流行情況也相當(dāng)嚴(yán)峻。 目前，CARTIs的治療指南中把β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素推薦做為一線用藥。青霉素曾是治療嚴(yán)重肺炎鏈球菌感染的首選用藥，但是，自19

2、67年澳大利亞首次分離出青霉素耐藥肺炎鏈球菌以來(lái)，青霉素耐藥肺炎鏈球菌(penicillin nonsuspective S. pneumoniae,PNSP)在全球各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin Binding Proteins，PBPs)介導(dǎo)的靶位改變是肺炎鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的基礎(chǔ)。 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥肺炎鏈球菌(Macrolide-Resistant S.Pneumoniae，MRSP)的迅速增

3、加也引起普遍關(guān)注。肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制主要有2種：由ermB介導(dǎo)的抗生素靶位改變和由mefA介導(dǎo)的外排泵出作用。近年來(lái)研究認(rèn)為，mefA和ermB雙陽(yáng)性的SP菌株與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)高度耐藥和多重耐藥相關(guān)度高。 四環(huán)素曾經(jīng)在發(fā)展中國(guó)家使用量很大。目前雖已逐漸退出臨床，但是重要的病原菌對(duì)這些藥物的耐藥性流傳甚廣。肺炎鏈球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性主要由tetM介導(dǎo)，也有少部分由tetO介導(dǎo)，這兩個(gè)基因都編碼核糖體保護(hù)蛋白。

4、 Tn1545是與肺炎鏈球菌紅霉素和四環(huán)素聯(lián)合耐藥關(guān)系密切的接合轉(zhuǎn)座子。 它攜帶紅霉素耐藥基因ermB、四環(huán)素耐藥基因tetM、氯霉素耐藥基因CatpC194以及卡那霉素耐藥基因aph3′-Ⅲ等基因。在呼吸道菌群中，由Tn1545介導(dǎo)的肺炎鏈球菌和其他菌種的耐藥基因的種問(wèn)交換，可與后續(xù)的抗生素選擇壓力共同導(dǎo)致多重耐藥菌的產(chǎn)生。近年來(lái)，耐藥肺炎鏈球菌在世界范圍內(nèi)的廣泛流行已引起醫(yī)學(xué)界的普遍關(guān)注。盡管耐藥性監(jiān)測(cè)和血清分型仍是主要的

5、手段，但分子分型具有更好的鑒別力，可用于不同來(lái)源的具有相近親緣關(guān)系的菌株檢測(cè)。各種全基因組分型方法已經(jīng)用于SP的常規(guī)分子分型，包括青霉素結(jié)合蛋白基因DNA指紋分型分析(DNAfingerprinting ofthe penicillin-binding protein genes)、BOX-PCR、脈沖場(chǎng)凝膠電泳多態(tài)性(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)、限制性片段末端標(biāo)記方法(Restrict

6、ion Fragment End L,abeling，RFEL)、多位點(diǎn)序列分型(MultilocusSequence Typing，MLST)等。 本課題選取分離自廣州地區(qū)社區(qū)獲得性呼吸道感染老年患者的33株肺炎鏈球菌，對(duì)其進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)和分子流行病學(xué)研究。研究分4部分進(jìn)行。第一部分在檢測(cè)SP對(duì)8種常用抗生素的敏感性的基礎(chǔ)上，與本地區(qū)及國(guó)內(nèi)相關(guān)研究的耐藥率和耐藥模式比較，探討廣州地區(qū)社區(qū)獲得性呼吸道感染老年患者肺炎鏈球菌臨床分

7、離株的耐藥特點(diǎn)。第二部分研究本地區(qū)SP對(duì)青霉素的耐藥特點(diǎn)，并驗(yàn)證PBP分型方法鑒定PSSP的特異性和靈敏度。第三部分研究肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和四環(huán)素耐藥的主要機(jī)制，及菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和四環(huán)素聯(lián)合耐藥的分子機(jī)制。第四部分用BOX-PCR分析菌株間親緣關(guān)系，并用MLST技術(shù)檢測(cè)部分多重耐藥菌株的ST分型。 研究目的: 1.調(diào)查廣州地區(qū)老年社區(qū)獲得性呼吸道感染患者中，肺炎鏈球菌對(duì)常用抗生素的敏感性。 2.驗(yàn)證PBP分

8、型方法鑒定PSSP的特異性和靈敏度，可否用此種簡(jiǎn)易快速的方法分辨PRSP與PSSP。 3.研究廣州地區(qū)老年人肺炎鏈球菌分離株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和四環(huán)素的耐藥機(jī)制。 4.分析廣州地區(qū)老年患者肺炎鏈球菌多重耐藥株的來(lái)源和親緣關(guān)系。 研究方法: 1.自2004年6月到2005年12月在廣州市第一人民醫(yī)院采集社區(qū)獲得性呼吸道感染老年患者的痰、支氣管沖洗液、血培養(yǎng)等標(biāo)本，培養(yǎng)分離，并用革蘭染色鏡檢、菊糖發(fā)酵、膽汁溶菌等方

9、法鑒定，最終確認(rèn)為33株肺炎鏈球菌。 2.用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定肺炎鏈球菌對(duì)8種抗生素的敏感性。 3.用試劑盒提取肺炎鏈球菌基因組DNA；PCR擴(kuò)增肺炎鏈球菌溶血素基因片段以鑒定SP；擴(kuò)增青霉素結(jié)合蛋白基因pbpla，pbp2x，pbp2b。 4.PCR擴(kuò)增大環(huán)內(nèi)酯耐藥基因ermB，mefA，及導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和四環(huán)素共同耐藥的結(jié)合轉(zhuǎn)座子Tn1545。 5.PCR擴(kuò)增肺炎鏈球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥基因teM片段，

10、并對(duì)回復(fù)突變體使用T載體進(jìn)行全序列克隆測(cè)序，與GenBank標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)比以確定是否存在突變。 6.用盒式PCR(BOX-PCR)分析33株SP的親緣關(guān)系。用多位點(diǎn)測(cè)序分型技術(shù)(MLST)檢測(cè)4株多重耐藥菌株的ST分型。 結(jié)果: 1.33株肺炎鏈球菌中有1株對(duì)青霉素中介耐藥(MIC為0.125 mg/L)。肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶\磺胺甲噫唑表現(xiàn)出較高的耐藥率，分別為分別為60.6％(n=20

11、)，51.6％(n=17)、69.7％(n=23)和72.9％(n=24)。對(duì)氯霉素的耐藥率為18.2％(n=6)，對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為27.2％(n=9)，對(duì)萬(wàn)古霉素均呈敏感。 2.75.8％(n=25)株對(duì)2種或以上抗生素聯(lián)合耐藥，耐3種以上不同種類(lèi)抗生素的多重耐藥株共19株，多重耐藥率57.6％。最多見(jiàn)的耐藥模式為紅霉素、克林霉素、四環(huán)素及甲氧芐啶/磺胺甲噁唑聯(lián)合耐藥，為31.6％(n=6)，其次為紅霉素、克林霉素與四環(huán)素

12、及甲氧芐啶/磺胺甲嗯唑、環(huán)丙沙星聯(lián)合耐藥，為15.8％(n=3)。 3.用PCR方法檢測(cè)PSSP準(zhǔn)確率為68.75％(n=22)。紙片法驗(yàn)證為PSSP的菌株，pbp2b基因擴(kuò)增率為87.5％(n=28)，pbp2x基因擴(kuò)增率為75％(n=24)，pbp1a基因擴(kuò)增率為12.5％(n=4)；中介耐藥菌株759未擴(kuò)增出pbp2b pbp2x基因，而pbp1a基因擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性。 4.20株紅霉素不敏感肺炎鏈球菌中，有19株檢

13、測(cè)出mefA和/或ermB基因。其中僅ermB占57.9％(n=11)，ermB和mefA同時(shí)陽(yáng)性占31.6％(n=6)，有2株未檢測(cè)到ermB或mefA。同時(shí)攜帶ermB基因和mefA基因的6株肺炎鏈球菌均表現(xiàn)為多重耐藥。 5.23株四環(huán)素不敏感肺炎鏈球菌的tetM基因株檢出率是95.7％(n=22)，10株四環(huán)素敏感肺炎鏈球菌的tetM基因檢出率為80％，四環(huán)素耐藥回復(fù)突變率34.8％(n=8)。 6.33株肺炎鏈球

14、菌中Tn1545的檢出率是69.7％(n=23)。17株四環(huán)素和紅霉素聯(lián)合耐藥的肺炎鏈球菌，Tn1545攜帶率為94.1％(n=16)。 7.34.8％(n=8)的四環(huán)素敏感株存在tetM耐藥基因，四環(huán)素耐藥回復(fù)突變株的tetM基因存在多處缺失、插入和點(diǎn)突變，且在前導(dǎo)序列的缺失導(dǎo)致移碼突變。 8.BOX-PCR可將這33株肺炎鏈球菌分為21型。 9.MLST分型顯示，4株多重耐藥菌株分屬ST271、ST236和S

15、T905型。 結(jié)論: 1.廣州地區(qū)社區(qū)獲得性呼吸道感染的老年患者中，分離到的肺炎鏈球菌對(duì)青霉素耐藥率較低，但對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、四環(huán)素、甲氧芐啶＼磺胺甲噁唑耐藥卻非常普遍。對(duì)萬(wàn)古霉素均呈敏感。 2.多重耐藥菌分離率高，耐藥模式以大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)合并四環(huán)素及甲氧芐啶＼磺胺甲噁唑?yàn)橹鳌?3.用PCR方法檢測(cè)PSSP準(zhǔn)確率為68.75％(n=22)，有一定的可行性。 4.廣州地區(qū)老年人肺炎鏈球菌臨床分離株對(duì)紅

16、霉素和四環(huán)素耐藥的主要機(jī)制分別是ermB編碼的靶位改變和tetM編碼的核糖體保護(hù)作用。 5.tetM基因變異可能是本地區(qū)肺炎鏈球菌對(duì)四環(huán)素耐藥回復(fù)突變的機(jī)制之一。6.接合性轉(zhuǎn)座子Tn1545的存在與tetM和ermB存在關(guān)系密切，可能是肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物和四環(huán)素等藥物多重耐藥的重要機(jī)制之一。 7.BOX-PCR顯示了較高的分辨率，能快速可靠地檢測(cè)菌株間的親緣關(guān)系。 8.廣州地區(qū)流行的耐藥克隆與Taiwan