高糖通過氧化應激反應激活TNF受體調控內皮祖細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的:目前,關于糖尿病血管病變的機制尚未完全闡明,存在有多種假說,其中內皮祖細胞(EPC)功能失調使糖尿病血管新生受損的機制研究已經(jīng)受到廣泛重視。內皮祖細胞對維持內皮細胞完整性、促進血管新生有重要作用,而高糖環(huán)境對內皮祖細胞數(shù)量和功能均有影響,主要使其凋亡增多,數(shù)量減少。糖尿病患者伴隨存在的氧化應激狀態(tài),促使細胞產(chǎn)生過量的ROS進而通過調控凋亡基因,激活凋亡受體等途徑,顯著增加細胞的凋亡,最終影響血管新生。腫瘤壞死因子(TNF-α)是一

2、種主要由單核-吞噬細胞產(chǎn)生的單核因子,主要參與細胞凋亡和炎癥反應的調控,其受體(TNFR1)在細胞凋亡的主要途徑死亡受體途徑中發(fā)揮重要作用。在高糖導致的氧化應激條件下,ROS激活TNFR1進而誘導EPC的凋亡可能是糖尿病血管新生障礙的重要因為之一。因此本實驗的研究目的在于,觀察體外高糖是否通過氧化應激反應激活TNF受體進而對大鼠骨髓源性內皮祖細胞(EPC)凋亡產(chǎn)生影響,探討高糖對內皮祖細胞影響。
　　 方法:1.骨髓EPC的分離

3、、培養(yǎng)和鑒定,倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)的EPC的形態(tài)、生長及增殖情況。用免疫組織化學和免疫熒光染色作CD34、CD133、VEGFR-2、ac-LDL和UEA-1檢測來鑒定EPC并計數(shù)。2高糖對EPCs的氧化應激相關產(chǎn)物MDA,GSH,抗O2-的影響。3.高糖及抗氧化劑對EPCs凋亡的影響。流式細胞儀檢測,Annexin-Ⅴ陽性的細胞認為是凋亡細胞,計算細胞凋亡率。4.PCR檢測高糖及抗氧化劑對EPCs TNF-αmRNA的表達情

4、況。
　　 結果:1.骨髓來源的EPC在體外培養(yǎng)時呈梭形,貼壁生長,二者均表達CD34,CD133和VEGFR-2表達,且能結合UEA-1并攝取ac-LDL,證明所培養(yǎng)細胞為內皮祖細胞。2.高糖作用24h后,與正常組相比,高糖干預組(30mmol／L,60mmol／L)EPCs的MDA,GSH濃度均無明顯差異,作用48h96h后,MDA,GSH濃度顯著增加(P<0.05),均高于對照組,并呈濃度及時間依賴性,15mmol／L高糖

5、組則無明顯增加。高糖作用48h,96h后,抗O2-濃度明顯減少(P<0.05),呈濃度及時間依賴性。3.流式細胞儀檢測細胞早期凋亡表明高糖組凋亡率高于對照組以及TEMPOL干預組(8.29±0.33)％,(13.08±0.68)％vs(2.54±0.47)％,(2.76±0.44)％vs(4.41±0.72)％,(5.12±0.53)％,P<0.05。3.PCR檢測TNFR1 mRNA含量顯示在48h,96h時高糖組表達增多,(1.41

6、3±0.115,1.656±0.133 vs0.982±0.099,0.975±0.113,P<0.05)TEMPOL能夠抑制TNFR-1 mRNA的表達。(1.072±0.126,1.035±0.114 vs1.413±0.115,1.656±0.133P<0.01)。
　　 結論:1.高糖能夠引起EPC氧化應激反應增強,抗氧化能力減弱,并呈時間和濃度依賴性。2.高糖能夠增加EPC早期凋亡率,抗氧化劑TEMPOL能夠抑制高糖引