芽孢桿菌N19中性蛋白酶發(fā)酵條件及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、中性蛋白酶是指其最適作用pH介于6.0～7.5之間的一類蛋白酶，能催化蛋白質(zhì)肽鍵水解，具有催化反應(yīng)速度快，無(wú)工業(yè)污染，催化反應(yīng)條件適應(yīng)性寬等獨(dú)特的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)。 本研究以酶工程實(shí)驗(yàn)室所保存的一株芽孢桿菌(Bacillus)N19為出發(fā)菌株，在搖瓶發(fā)酵水平上，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究，確定了其最佳培養(yǎng)基成分及最佳培養(yǎng)條件。研究了不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、金屬離子等因素對(duì)芽孢桿菌(Bacillus)N19產(chǎn)酶的影響，發(fā)現(xiàn)牛肉膏、蛋白胨

2、、酵母膏、NaCl濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響較大。對(duì)此四因素各選取三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定芽孢桿菌(Bacillus)N19產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基成分為牛肉膏11g/L,酵母膏12 g/L，蛋白胨20 g/L，NaCl 4 g/L。通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，確定其最佳培養(yǎng)條件為:搖床42℃，250 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH為4.5，接種量2％(V/V)，裝液量為40 mL/300mL，培養(yǎng)44h。 芽孢桿菌中性蛋白酶在37℃發(fā)酵后，收集發(fā)酵液

3、，經(jīng)過(guò)濾、硫酸銨鹽析、Sephadex G-25脫鹽、DEAE-維素-52離子強(qiáng)度梯度層析、SephacrylTM S-200凝膠過(guò)濾等純化工藝分離純化之后，經(jīng)PAGE電泳鑒定得到單一條帶，達(dá)到電泳純。比活力提高到6214.7U/mg，純化倍數(shù)為20.1倍，回收率為12.87％。 純化的芽孢桿菌中性蛋白酶以酪蛋白為底物時(shí)的酶學(xué)性質(zhì)為:最適溫度70℃，在低于60℃或者高于80℃時(shí)，相對(duì)酶活力明顯下降；該中性蛋白酶在50℃下作用2h

4、，其相對(duì)酶活只有26.35％，而60℃只有3.6％，70℃下處理20分鐘酶活下降至14.3％；最適pH為6.8，作用范圍較寬，在pH6.0～8.0范圍內(nèi)均具有較高的酶活性，pH耐受性比較好；Fe2+對(duì)中性蛋白酶有顯著激活作用，可使其酶活提高394.65％，EDTA對(duì)酶活有一定的抑制作用；以酪蛋白為底物采用雙倒數(shù)作圖法測(cè)得Km為3.1×10-3g/mL；SDS-PAGE電泳顯示芽孢桿菌中性蛋白酶分子量37.7KDa。 本論文對(duì)芽孢