高遷移率族蛋白B1對人T淋巴細胞免疫功能影響的體外研究.pdf

1、研究背景：膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展反映了體內抗炎/促炎免疫平衡失控的過程，T細胞免疫活性由Th1優(yōu)勢向Th2優(yōu)勢漂移預示獲得性免疫功能抑制，形成免疫麻痹，誘發(fā)多臟器功能障礙甚至死亡，而導致免疫狀態(tài)呈現(xiàn)抗炎優(yōu)勢的確切原因尚待闡明。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為“晚期”炎癥因子介導了膿毒癥發(fā)病過程，廣泛參與炎癥反應調節(jié)和臟器功能損害，研究其病理生理效應和致病途徑將有助于深化對膿毒癥發(fā)病機制的認識，并為免疫平衡的調控提供潛在的干預目標。本研究

2、將觀察HMGB1在體外對人T淋巴細胞免疫功能的影響。 方法：分離健康人靜脈血PBMC細胞，在含10％小牛血清的1640中調整細胞濃度2×106/ml接種于細胞培養(yǎng)板。以20μg/mlPHA作為非特異性刺激劑激活細胞體外增殖。實驗一：rhHMGB1作用劑量1～1000ng/ml，刺激時間12～48小時。細胞培養(yǎng)72小時后，以MTT法檢測細胞數(shù)量和細胞活力，觀察HMGB1對T淋巴細胞增殖的影響。采用四色流式細胞術(FCM)分析CD3

3、+淋巴細胞CD4表達和胞內因子IFN-γ、IL-4分泌陽性(Th1、Th2)的比例。實驗二：rhHMGB1作用劑量10～1000ng/ml，刺激時間12、48小時。在rhHMGB1刺激12、48小時后收集細胞與培養(yǎng)液上清。IL-2、IL-2Rα基因表達水平的測定采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法分析。提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA后以IL-2、IL-2Rα鏈為目的基因、β-actin為內參行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳回收

4、PCR產物，照片判定積分光度值。上清IL-2、sIL-2R蛋白含量用ELISA法檢測。 結果：(1)500ng/ml以上劑量HMGB1作用48小時后，淋巴細胞增殖顯著抑制，低于這一劑量對增殖影響不顯著。(2)不同HMGB1刺激時間和作用劑量對CD4+T淋巴細胞和Th1亞群比例未造成明顯改變，但發(fā)現(xiàn)HMGB1能時間-劑量依賴性增加Th1亞群比例，并因此降低Th1/Th2比值，提示在刺激后T淋巴細胞免疫功能出現(xiàn)Th1優(yōu)勢向Th2優(yōu)勢

5、偏移。(3)經PHA激活后，T淋巴細胞IL-2、IL-2Rα基因表達和上清IL-2、sIL-2R蛋白濃度分別于12小時和24～48小時達到峰值。HMGB1與T淋巴細胞共培養(yǎng)12小時后，10ng/ml以上劑量即可明顯上調IL-2、IL-2Rα基因表達水平與蛋白產生量。而HMGB1刺激持續(xù)48小時上述效應衰竭，并表現(xiàn)出相反變化趨勢。 結論：研究證實，HMGB1對T淋巴細胞包括增殖、分化和因子分泌等免疫功能具有直接調節(jié)效應。劑量蓄積和