利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行米曲霉新菌株的選育.pdf

1、米曲霉(Aspergillus oryzae)是釀造業(yè)中的重要微生物，在其生長過程中能分泌多種酶系，其中較重要的是蛋白酶，可將豆類中的蛋白質(zhì)降解成多肽、氨基酸等可溶性氮物，對醬油、豆瓣、米酒等的產(chǎn)率和風(fēng)味起著重要作用；然而現(xiàn)在工業(yè)用米曲霉菌株蛋白酶活性高的往往生長速度慢，生長速度快的菌株往往蛋白酶活性低，這就大大降低了生產(chǎn)效率，影響了生產(chǎn)質(zhì)量。所以目前我國的釀造業(yè)中，米曲霉菌株的選育是個(gè)熱點(diǎn)?，F(xiàn)在國內(nèi)對米曲霉菌株的選育方法主要采用物理和

2、化學(xué)的誘變，但是誘變工作量大，隨機(jī)性也較大，不易得到理想菌種。針對生產(chǎn)實(shí)踐中的這一情況，本試驗(yàn)通過原生質(zhì)體融合方法來選育生長速度快且蛋白酶活力高的新菌株。原生質(zhì)體融合，就是將雙親株的微生物細(xì)胞分別通過酶解脫壁，使之形成原生質(zhì)體，然后在高滲的條件下混合，并加入物理的或者化學(xué)的或者生物的助融條件，使雙親株的原生質(zhì)體間發(fā)生相互凝集，通過細(xì)胞質(zhì)融合，核融合，而后發(fā)生基因組間的交換重組，進(jìn)而可以在適宜的條件下再生出微生物的細(xì)胞壁來，再通過合理的篩

3、選程序，從再生細(xì)胞中獲得重組子的過程。 本試驗(yàn)選取了生長速度快但蛋白酶活性低的米曲霉菌株AS3.951和生長速度慢但蛋白酶活性高的米曲霉菌株CICC2339作為原始親本菌株。首先選用纖維素酶、溶壁酶、蝸牛酶以7：3：1比例混合配成復(fù)合酶對其細(xì)胞壁進(jìn)行酶解制備原生質(zhì)體，其原生質(zhì)體形成量約為10<'6>個(gè)/ml：然后選用紫外、微波及超聲波三種不同的滅活方法進(jìn)行雙親滅活，探討每種滅活方法的最佳條件，并通過所得融合子的性狀選出最適合米曲

4、霉的滅活方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)米曲霉菌株AS3.951采用紫外滅活，米曲霉菌株CICC2339采用超聲波一熱滅活方法，其融合子性狀最好。在選取最佳滅活方法的基礎(chǔ)上，我們采用了原生質(zhì)體電融合，探討了電融合的最佳條件，即成串脈沖頻率1MHz，成串電壓40V，融合脈沖電壓400V，脈沖寬度80ps，脈沖個(gè)數(shù)6個(gè)；通過電融合初篩出一批新菌株，并與傳統(tǒng)PEG融合法選育出的菌株進(jìn)行了性狀上的比較；最后對初篩出來的米曲霉菌株進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)，每隔兩代通過福林-酚