DNA拷貝數(shù)變異與克羅恩病的關聯(lián)研究.pdf

1、第一部分
　　目的:通過一種高通量比較基因組雜交芯片對中國克羅恩病患者人群進行檢測,力圖發(fā)現(xiàn)此患者群中可能存在的DNA拷貝數(shù)變異區(qū)域。后通過擴大病例樣本量對從中篩選發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)變異區(qū)域進行驗證,同時在克羅恩病患者的不同組織中、不同表達水平對發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)變異區(qū)域中相關基因進行檢測。再對發(fā)現(xiàn)的染色體DNA拷貝數(shù)變異區(qū)域?qū)肆_恩病發(fā)病的影響機制進行進一步探討。
　　方法:通過羅氏Nimblegen2.1M比較基因組雜交芯片技術,對

2、8例中國克羅恩病患者的黏膜組織及外周血標本進行檢測,同期以羅氏公司提供的正常人標準品作對照,篩選出與中國克羅恩病患者相關的DNA拷貝數(shù)變異區(qū)域。收集臨床克羅恩病病例標本擴大樣本量,在外周全血標本中對篩選出的DNA拷貝數(shù)變異區(qū)域相關基因拷貝數(shù)進行定量PCR檢測,并將檢測結果與克羅恩病患者臨床資料進行相關性分析;在腸黏膜活檢組織標本中通過FISH法對該片段包含的基因拷貝數(shù)變化進行測定;并在外周血血漿中通過ELISA法對該DNA拷貝數(shù)變異基因

3、進行分泌性蛋白檢測。后以宮頸癌Hela細胞株作為工具細胞,將這一DNA拷貝數(shù)擴增的基因CNTNAP3構建高表達質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染入Hela細胞中,觀察高表達后的該基因在不同時間點對ATGl6L1,ATG5,LC3及RJPK2等與細胞自噬及CARD通路相關基因的影響,同時通過流式細胞儀測定該高表達基因?qū)ela細胞凋亡影響。使用全基因組表達譜芯片對克羅恩病外周血單個核細胞基因轉(zhuǎn)錄水平表達變化作檢測。
　　結果:高通量比較基因組雜交芯片對8例

4、中國克羅恩病患者檢測后發(fā)現(xiàn),克羅恩病患者中拷貝數(shù)變異區(qū)域相對較少,變異片段大小＞2Mb的區(qū)域僅發(fā)現(xiàn)一處,為擴增變異且變異豐度不高。該大片段變異區(qū)域中目前僅有兩個已經(jīng)對其功能有一定研究的基因,分別是CNTNAP3及PGM5。擴大病例樣本后在93例克羅恩病患者外周血中驗證檢測CNTNAP3拷貝數(shù)變異,同期與80例正常人作對照后發(fā)現(xiàn)該基因拷貝數(shù)確實存在擴增情況。分層分析后發(fā)現(xiàn)該基因拷貝數(shù)擴增變異在未使用過激素治療的病例中差異更明顯,且吸煙組該

5、基因拷貝數(shù)也高于非吸煙組,未發(fā)現(xiàn)其余臨床指標與該基因拷貝數(shù)變異存在相關性。FISH檢測克羅恩病患者病變腸黏膜組織中亦有CNTNAP3基因擴增表現(xiàn)。克羅恩病患者外周血血漿中未明顯表達CNTNAP3蛋白,與正常人作對照也無顯著性差異。Hela細胞高表達CNTNAP3基因之后,其蛋白水平表達亦有同步上調(diào)。自噬基因ATGl6L1、ATG5表達皆有不同程度上調(diào),且ATG16L1與CNTNAP3表達呈明顯時間相關性;而CARD相關基因RIPK2表達

6、則有抑制;CNTNAP3重組質(zhì)粒在各時間點對Hela細胞凋亡無特別影響。
　　克羅恩病患者外周血單個核細胞中存在大量表達差異的基因,按P＜0.05合并FC值＞2(或FC值＜0.5)標準發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因有905個,下調(diào)基因有414個。將差異基因聚類分析后可將克羅恩病組及正常對照組分開,這些基因與炎癥反應、細胞生長與維持、蛋白水解,能量代謝及為分類功能有關。全基因組表達譜芯片發(fā)現(xiàn)CNTNAP3基因在克羅恩病組存在表達上調(diào)趨勢,但暫未發(fā)現(xiàn)存

7、在顯著性差異。
　　結論:克羅恩病患者存在DNA拷貝數(shù)變異狀態(tài),但變異區(qū)域較少,大片段DNA拷貝數(shù)變異區(qū)域可能更少。定量PCR法驗證了比較基因組雜交芯片結果,CNTNAP3DNA拷貝數(shù)在克羅恩病組存在高于正常人組的擴增現(xiàn)象,該擴增現(xiàn)象在克羅恩病組可能受激素治療及吸煙影響?？肆_恩病組腸道黏膜組織中同樣發(fā)現(xiàn)有CNTNAP3拷貝數(shù)擴增變異現(xiàn)象?？肆_恩病患者外周血血漿中發(fā)現(xiàn)少量CNTNAP3蛋白存在,與正常人組無差異。CNTNAP3基因可

8、能通過改變自噬途徑影響克羅恩病的發(fā)病。全基因組表達譜芯片可篩選出克羅恩病組患者外周血單個核細胞中較多表達差異的基因。
　　第二部分：
　　目的:對阿達木單抗治療成人CD的療效和安全性進行系統(tǒng)分析,以客觀評價其對成人中重度CD的治療價值。
　　方法:聯(lián)機檢索Medline、PubMed、Embase和Cochrane協(xié)作網(wǎng),納入阿達木單抗治療成人CD的RCT和相關文獻,應用RevMan4.2軟件行薈萃分析。
　　結

9、果:共4篇文獻納入本薈萃分析。阿達木單抗對成人CD的誘導緩解率(OR=2.98,95％CI:1.78～4.99,P＜0.0001)和維持緩解率(OR=4.79,95％CI:2.96～7.73,P＜0.00001)均高于安慰劑組,差異有統(tǒng)計學意義;誘導治療的不良反應發(fā)生率低于安慰劑組,差異有統(tǒng)計學意義(OR=0.60,95％CI:0.42～0.87,P=0.007);維持治療的不良反應發(fā)生率與安慰劑組相當(OR=1.09,95％CI:0.