環(huán)孢素A和他克莫司在體外對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制影響的對(duì)比研究.pdf

1、背景：我國(guó)是乙型肝炎病毒(hepaititisBvirus，HBV)感染高發(fā)地區(qū)之一，乙肝相關(guān)性終末期肝病已成為我國(guó)肝移植的最主要指征，但此類患者肝移植術(shù)后面臨著一個(gè)普遍且棘手的問(wèn)題便是HBV再感染。HBV再感染是移植肝功能喪失及患者死亡的重要原因，HBV再感染后，病毒復(fù)制較移植前大量增加，可以迅速導(dǎo)致持續(xù)的移植肝功能損害、肝硬化及肝功能衰竭，最終導(dǎo)致患者死亡或再次肝移植，嚴(yán)重影響了肝移植的遠(yuǎn)期療效。HBV再感染的影響因素很多，現(xiàn)普遍認(rèn)

2、為移植后免疫抑制劑的應(yīng)用、術(shù)前病毒復(fù)制狀態(tài)、病毒基因型、術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)預(yù)防方案、排斥反應(yīng)等都是引起HBV再感染的重要原因。目前肝移植臨床免疫抑制方案多種多樣，但不外乎以環(huán)孢素A(cyclosporineA，CsA)為基礎(chǔ)的免疫抑制方案和以他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)為基礎(chǔ)的免疫抑制方案兩種。根據(jù)歐洲及美國(guó)開(kāi)展的關(guān)于CsA和FK506肝移植臨床療效對(duì)比的前瞻性、隨機(jī)對(duì)照的多中心研究，結(jié)果表明FK506在降低急慢性排斥反應(yīng)發(fā)生

3、率和嚴(yán)重程度、患者和移植物長(zhǎng)期存活等方面優(yōu)于CsA。美國(guó)學(xué)者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者若接受FK506治療，其患者生存率明顯高于CsA組；也有報(bào)道顯示丙型肝炎患者肝移植術(shù)后若接受FK506治療，則丙型肝炎復(fù)發(fā)概率低于CsA治療患者，同時(shí)亦發(fā)現(xiàn)血清病毒RNA滴度明顯低于CsA組。迄今為止，關(guān)于該兩種免疫抑制方案對(duì)肝移植術(shù)后HBV復(fù)發(fā)的影響鮮有報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。 HepG2.2.15細(xì)胞系是肝癌細(xì)胞系HepG2永久轉(zhuǎn)染4個(gè)全長(zhǎng)HB

4、V基因組而建立的，為研究藥物的抗HBV活性和作用機(jī)理提供了一個(gè)有效的體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１狙芯坷迷摷?xì)胞系，來(lái)評(píng)價(jià)常用免疫抑制劑CsA和FK506在體外對(duì)HBV基因復(fù)制、病毒蛋白合成的影響，以期能指導(dǎo)HBV相關(guān)性終末期肝病患者肝移植術(shù)后免疫抑制用藥，從而減少肝移植術(shù)后HBV復(fù)發(fā)率及嚴(yán)重程度，最終提高患者肝移植術(shù)后遠(yuǎn)期療效。 實(shí)驗(yàn)方法：將不同濃度的CsA(0～200μg/ml)及FK506(0～5000ng/ml)作用于HepG2.2.

5、15細(xì)胞共4天，采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，計(jì)算藥物作用下培養(yǎng)細(xì)胞存活率。若某一濃度的CsA或FK506作用下培養(yǎng)細(xì)胞存活率＞95％，則認(rèn)為該濃度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)毒性，由此確定CsA和FK506作用的安全濃度范圍。確定CsA和FK506的藥物安全濃度后，將不同安全濃度的CsA(0～20.0μg/ml)或FK506(0～100ng/ml)作用于該細(xì)胞系，每24h收集培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)上清液中乙型肝炎表面抗原(

6、hepatitisBsurfaceantigen，HBsAg)和乙型肝炎e抗原(hepatitisBeantigen，HBeAg)水平，計(jì)算HBsAg和HBeAg的抑制率。藥物作用共4天后收集培養(yǎng)細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)DNA，采用狹縫印記雜交法半定量分析細(xì)胞內(nèi)HBVDNA復(fù)制相對(duì)水平。以HBsAg、HBeAg抑制率及細(xì)胞內(nèi)HBVDNA復(fù)制水平為觀察指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)CsA和FK506對(duì)HBV病毒復(fù)制的影響。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.5

7、統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析比較各藥物作用組和對(duì)照組之間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，采用雙變量相關(guān)性Spearman檢驗(yàn)分析藥物作用濃度與各檢測(cè)指標(biāo)抑制程度之間的相關(guān)關(guān)系，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示CsA濃度在0～40.0μg/mL范圍內(nèi)、FK506濃度在0～400ng/mL范圍內(nèi)時(shí)培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞存活率＞95％，故由此確定CsA的藥物作用安全濃度為0～40.0μg/ml，F(xiàn)K506的安全濃度為0～4

8、00ng/ml。在安全濃度范圍內(nèi)，ELISA結(jié)果顯示在CsA作用第2、3、4天，隨著CsA作用濃度的增加，其對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率逐漸上升，且Spearman檢驗(yàn)顯示抗原抑制率與CsA濃度呈正性相關(guān)聯(lián)系；狹縫印跡雜交顯示在CsA處理4天后，隨著CsA作用濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)HBVDNA復(fù)制水平逐漸下降，且Spearman檢驗(yàn)顯示HBVDNA復(fù)制水平與CsA濃度呈負(fù)性相關(guān)聯(lián)系。當(dāng)1.3、2.5及5.0μg/mlCsA作用4天時(shí)，對(duì)

9、HBsAg的抑制率分別為(16.5±9.4)％、(21.5±8.9)％和(33.1±5.3)％，對(duì)HBeAg的抑制率分別為(7.8±2.2)％、(11.0±2.3)％和(20.8±1.5)％，HBVDNA的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的(56.1±16.5)％、(41.7±10.9)％和(39.5±9.5)％。在安全濃度范圍內(nèi)，不同濃度FK506作用下HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的抗原抑制率、細(xì)胞內(nèi)HBVDNA復(fù)制水平均未見(jiàn)明顯規(guī)