siRNA干擾Nrf2對喉鱗狀細胞癌化療敏感性的影響.pdf

1、目的：
　　1.探討小分子干擾RNA（siRNA）技術抑制核因子NF—E2相關因子-2（nuclear factor-E2-related factor,Nrf2）的表達對人喉癌Hep2細胞化療敏感性及凋亡的影響
　　2.探討SUMO特異性蛋白酶3（SUMO-specific protease3，SENP3）對Nrf2信號通路表達的影響
　　研究方法：
　　1.運用siRNA干擾技術，采用脂質體轉染法抑制喉癌細胞

2、系Hep2中Nrf2表達，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢驗其轉染效果。
　　2.應用CCK-8比色技術行細胞增殖-毒性實驗，設立實驗組（Hep2/Nrf2-siRNA，轉染Nrf2質粒）和對照組(Hep2/control-siRNA，空質粒組)，未行轉染處理的Hep2細胞作為空白對照組。化療藥物順鉑（Cisplatin，DDP）設置不同濃度梯度分別處理上述三組細胞24h。分光光度計檢測24h時的各組OD值。計算各組細

3、胞的增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度（IC50）值。
　　3.通過Annexin-V、PI雙標的凋亡試劑檢測法，分別檢測經順鉑處理的Hep2/Nrf2-siRNA、Hep2/control-siRNA、未轉染Hep2三組細胞的凋亡率。熒光顯微鏡觀察各組細胞凋亡情況。
　　4.以慢病毒為載體，將shRNA-SENP3目的基因轉染喉癌Hep2細胞，Western Blot檢測shRNA對SENP3的抑制效率。同時WB法檢測穩(wěn)轉敲除SEN

4、P3的Hep2細胞中Nrf2、HO-1表達。
　　5. CCK-8比色法行細胞增殖-毒性實驗，檢測Hep2/shRNA-SENP3與對照組增殖抑制率差異。
　　結果：
　　1.siRNA干擾Nrf2表達后，不同濃度下順鉑對Hep2細胞的增殖抑制率均較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義。而其IC50值（5.27μg/ml）也低于對照組細胞。
　　2.AnnexinV/PI雙標檢測細胞凋亡率，順鉑同時處理細胞24h，Hep

5、2/Nrf2-siRNA組凋亡率較對照組增加。提示下調Nrf2表達增強了順鉑的促凋亡作用。
　　3.建立穩(wěn)定低表達SENP3的Hep2，Western Blot檢測Nrf2、HO-1表達均出現(xiàn)下調。順鉑對敲除SENP3的穩(wěn)轉株Hep2抑制作用較對照組增強。
　　結論：
　　下調Nrf2表達可增強Hep2對順鉑的化療敏感性，并增強其促凋亡作用。敲除Hep2中SENP3基因，可下調Nrf2-ARE信號通路，而增強了其化療敏