Rno-let-7d調節(jié)半乳糖凝集素3表達在ADHD大鼠腦中的作用.pdf

1、目的：比較ADHD大鼠模型SHR大鼠與WKY大鼠行為學差異,驗證SHR.大鼠作為ADHD動物模型的可靠性；比較SHR大鼠與WKY大鼠主要腦區(qū)、主動脈、肝臟中半乳糖凝集素3的表達差異；篩查并證明半乳糖凝集素3和酪氨酸羥化酶相關microRNAs；明確半乳糖凝集素3是否能夠影響TH的表達。
　　 方法：開場實驗比較SHR大鼠與WKY大鼠自發(fā)活動差異；l(a)t迷宮比較SHR大鼠與WKY大鼠非選擇性注意差異；western blot、

2、PCR、免疫組化檢測主要腦區(qū)半乳糖凝集素3蛋白及mRNA表達水平；利用芯片技術篩查SHR、WKY大鼠腦前額區(qū)microRNAs差異,通過數(shù)據(jù)庫比較,確定可能相關的microRNAs;維甲酸(RetinoicAcid,RA)處理低分化PC12細胞后,PCR檢測microRNAs表達；構建microRNAs表達載體、熒光素酶報告載體；共轉染microRNAs表達載體、熒光素酶報告載體檢測熒光素酶活性；轉染microRNAs表達載體,檢測79

3、19細胞和(或)PC12細胞半乳糖凝集素3及酪氨酸羥化酶表達;PCR、western blot、免疫組化、免疫熒光檢測高、低分化PC12細胞半乳糖凝集素3及TH表達;RA處理低分化PC12細胞后,PCR、western blot檢測半乳糖凝集素3及TH表達；神經(jīng)生長因子(NerveGrowth Factor,NGF)處理高分化PC12細胞后,PCR、western blot檢測半乳糖凝集素3及TH表達；構建半乳糖凝集素3表達質粒及干擾質

4、粒,分別轉染高、低分化PC12細胞后,檢測半乳糖凝集素3及TH表達。
　　 結果：開場實驗中SHR大鼠穿越格子數(shù)、直立次數(shù)明顯多于WKY大鼠；l(a)t迷宮中SHR大鼠穿越角落、直立次數(shù)明顯多于WKY大鼠；與WKY大鼠相比,SHR大鼠前額區(qū)、紋狀體、中腦半乳糖凝集素3蛋白表達分別下降38％、57％、45％左右,而在小腦、主動脈、肝臟沒有明顯下降；在SHR大鼠前額區(qū),mo-let-7d是唯一升高的microRNA；RA處理低分化P

5、C12細胞后,mo-let-7d表達升高；7919細胞和PC12細胞分別共轉染mo-let-7d表達載體、熒光素酶報告載體(包含Lgals3-3’UTR),顯示luciferase活性降低,點突變Lgals3-3’UTR結合位點(C→G)結果發(fā)現(xiàn),突變后mo-let-7d過度表達對luciferase活性的抑制消失；瞬時轉染mo-let-7d表達載體,結果顯示mo-let-7d過度表達使低分化PC12細胞和7919細胞半乳糖凝集素3蛋白

6、水平分別降低約34％和40％,但mRNA水平?jīng)]有明顯改變,并使低分化PC12細胞酪氨酸羥化酶表達下降約38％；共轉染mo-let-7d表達載體、熒光素酶報告載體(包含TH-3,UTR)結果顯示mo-let-7d過表達并沒有使luciferase活性降低:高分化PC12細胞相對低表達半乳糖凝集素3和TH,低分化PC12細胞相對高表達半乳糖凝集素3和TH；RA同時下調低分化PC12細胞半乳糖凝集素3和酪氨酸羥化酶表達；NGF同時上調高分化P