自噬在腎小球足細胞損傷中的作用機制研究.pdf

1、摘要1:
　　目的：借助足細胞，觀察Angll及小分子干擾RNA(siRNA)沉默TRPC6后對足細胞凋亡率和自噬的影響，以探討其分子機制。
　　方法：①設計、合成實驗組和對照組小分子干擾RNA(siRNA)，轉染足細胞，使TRPC6基因沉默，采用流式細胞術、RT-PCR及Western Blot技術檢測不同濃度siRNA轉染后TRPC6基因表達，優(yōu)化獲得TRPC6基因沉默最佳效果的條件。②體外培養(yǎng)小鼠腎小球足細胞，設立對照

2、組，Angll刺激組，TRPC6基因沉默組和3-MA組。對照組用含0.02％DMSO的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；Angll刺激組加入Angll（10-8M）刺激MPC5；TRPC6基因沉默組運用基因沉默技術沉默TRPC6；3-MA組加入3-MA（2mM），處理后12h，24h和48h觀察細胞形態(tài)并攝相。采用流氏細胞儀檢測足細胞凋亡率，RT-PCR、Western blot檢測自噬相關蛋白的表達，激光共聚焦電子顯微鏡觀察自噬相關蛋白的分

3、布。
　　結果：①siRNA轉染后TRPC6基因mRNA和蛋白的表達，30nM的TRPC6-siRNA轉染24h后TRPC6 mRNA表達量最低。②Angll組足細胞凋亡率明顯升高，沉默TRPC6使足細胞凋亡率明顯降低，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。③透射電鏡下Angll組示足細胞超微結構發(fā)生改變，自噬表達增加，胞質中出現(xiàn)獨立雙層膜結構，胞質成分及溶酶體等細胞器形成雙層及多層膜結構的自噬體。沉默TRPC6使自噬表達下降

4、，與Angll組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。④Angll組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達增加，沉默TRPC6和自噬特異性阻斷劑3-MA使LC3-Ⅱ表達下降，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P﹤0.01)。⑤激光共聚焦檢測Angll組LC3-Ⅱ的表達增加，沉默TRPC6使LC3-Ⅱ表達趨于穩(wěn)定，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P﹤0.01)。
　　結論：Angll促進足細胞的凋亡，沉默TPRC6抑制凋亡；沉默TRPC6和自噬特異性抑制劑3-M

5、A使自噬相關基因LC3-Ⅱ蛋白表達下調，達到保護自噬，發(fā)揮保護足細胞的作用。認為沉默TPRC6在Angll誘導的足細胞自噬與凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　摘要2:
　　目的：本研究旨在觀察腎臟自噬相關基因 LC3-Ⅱ在阿霉素腎病大鼠模型中不同病理時期的表達及定位分布的變化情況，研究其與腎小球足細胞病變過程的相互作用，探討自噬在蛋白尿發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。
　　方法：阿霉素大鼠腎病模型的建立，正常30只大鼠為對照組和30

6、只阿霉素腎病大鼠為模型組。觀察各組在2、4、6、8和10周各項指標的變化：①血肌酐、血膽固醇、血漿白蛋白、24h尿蛋白定量和血尿素氮；②各時間點熒光顯微鏡觀察腎臟自噬相關基因LC3-Ⅱ定位分布的變化；③兩組大鼠進行HE、PAS、Masson染色行病理學檢測。④各時間點透射電子顯微鏡檢測腎臟自噬體的表達與變化。
　　結果：①模型組出現(xiàn)高脂血癥和大量蛋白尿，肌酐(Scr)及尿素氮（BUN）水平均比對照組顯著升高，有統(tǒng)計學差異（p<0.

7、05）。結果顯示阿霉素腎病大鼠病理表現(xiàn)為腎病綜合征，并最終發(fā)展為腎功能衰竭。②透射電子顯微鏡下模型組足細胞在病變早期出現(xiàn)系膜細胞增生，線粒體腫脹，足突增寬及融合；晚期觀察到足突消失及核固縮。③HE、PAS和Masson染色，2周時系膜增生，4周系膜細胞發(fā)生空泡變性；6周發(fā)現(xiàn)FSGS的形成；8周80%腎小球內見玻璃樣變，腎小管萎縮。④透射電鏡及免疫熒光顯微鏡下，正常組大鼠腎組織自噬表達量較低，模型組自噬的表達量異常，在第2周及第10周自噬