PLMTs家族成員SET7-9甲基化p53對NF-κB途徑的影響.pdf

1、研究背景與目的：SET7/9是蛋白賴氨酸甲基轉移酶(protein lysine methyltransferases，PLMTs或PKMTs)家族成員，除了能使組蛋白H3第四位賴氨酸(lysine4 of histone3，H3K4)單甲基化外，更重要的是使一些轉錄因子、腫瘤抑制因子、膜相關受體等非組蛋白單甲基化。p53與p65都是細胞內重要的轉錄因子，兩者相互作用，共同參與調控細胞生長、分化、凋亡、癌變和個體發(fā)育等生命活動。同時，p

2、53與p65都是SET7/9甲基化作用底物。近來發(fā)現(xiàn)SET7/9能通過甲基化第372位賴氨酸(K372)調節(jié)p53的穩(wěn)定性。本研究初步觀察了SET7/9甲基化p53對NF-κB途徑的效應。
　　實驗方法與結果：
　　(一)分析SET7/9甲基化作用對p53途徑的影響。首先用1μmol·L-1濃度的阿霉素(Adriamycin，Adr)處理HEK293細胞20h，RT-PCR法檢測p21 mRNA表達水平，可見Adr處理HEK

3、293細胞后p21 mRNA表達明顯增加，流式細胞儀檢測顯示Adr作用后HEK293細胞凋亡率上升，提示DNA損傷后p53途徑激活；若用1 mmol·L-1。濃度的廣譜蛋白甲基化抑制劑MTA處理細胞1h，再用Adr處理20h，則可抑制Adr誘導的p21表達，說明p53途徑活化與胞內蛋白甲基化修飾有關；細胞轉染SET7/9表達載體(pCMV-SET7/9)、SET7/9干擾RNA(shRNA-SET7/9)質粒后再用1μmol·L-1Ad

4、r處理20h，結果表明SET7/9強化表達時Adr誘導的p21表達量明顯增高，敲除SET7/9則抑制Adr誘導的p21表達，證實了SET7/9對p53途徑活化的調節(jié)作用。細胞轉染p53干擾RNA(shRNA-p53)或空載體(pIRES2-ZsGreen1)后用Adr處理20h，發(fā)現(xiàn)敲除p53基因能抑制p53表達及SET7/9依賴的p21表達，而將野生型和突變型p53(p53K372R)分別轉染HEK293細胞，檢測細胞凋亡率，結果顯示

5、轉染野生型p53后，SET7/9過表達可促進HEK293細胞的凋亡，而轉染突變型p53后，SET7/9過表達對細胞凋亡無明顯影響，提示SET7/9激活p53途徑的效應是通過甲基化p53實現(xiàn)的。
　　(二)分析SET7/9誘導的p53甲基化對NF-κB途徑的影響。細胞分別轉染質粒pCMV-SET7/9、shRNA-SET7/9后用Adr處理或不處理，酶標儀檢測NF-κB途徑靶向熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)pCMV-SET7/9轉染+Adr處理

6、組熒光素酶活性比pCMV轉染+Adr組熒光素酶活性高，shRNA-SET7/9質粒轉染+Adr處理組熒光素酶活性比pCMV+Adr組熒光素酶活性低，提示SET7/9對p53途徑的甲基化作用可調節(jié)NF-κB途徑活性。pCMV-SET7/9轉染+Adr處理組熒光素酶活性比轉染pCMV-SET7/9組高，表明SET7/9過表達時Adr誘導p53途徑激活與NF-κB途徑活性變化相關，shRNA-SET7/9質粒轉染+Adr處理組熒光素酶活性與s