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1、[目的]:觀察缺氧/復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4、AQP5的表達(dá)變化以及亞低溫對(duì)其表達(dá)變化的影響,探討腦缺血再灌注腦水腫與AQP4、AQP5的關(guān)系以及亞低溫對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。 [方法]:利用新生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠,取皮層新鮮腦組織,經(jīng)機(jī)械分離和化學(xué)消化,制作細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為5×10<'5>/cm<'2>,接種到含胎牛血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,置培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng),利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的形態(tài)學(xué)變化
2、。培養(yǎng)8-9天后傳代,當(dāng)傳至第3代,細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定,自然純化后,神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glia fibrillary acid protein,GFAP)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞,95%以上為陽(yáng)性細(xì)胞,符合實(shí)驗(yàn)要求。將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為正常對(duì)照組(C)、常溫缺氧/復(fù)氧組(H/R)、亞低溫干預(yù)缺氧/復(fù)氧組(M+H/R)。用三氣培養(yǎng)箱分別調(diào)節(jié)溫度37℃及32℃,以95%N<,2>和5%CO<,2>造成細(xì)胞缺氧,用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定37℃及
3、32℃時(shí),缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)AC的存活率,作為細(xì)胞受損指標(biāo),用倒置相差顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)檢驗(yàn)缺氧/復(fù)氧各個(gè)時(shí)間點(diǎn)AQP4、AQP5的表達(dá)變化及亞低溫的干預(yù)效果。 [結(jié)果]: 1.體外培養(yǎng)的AC傳3代后,細(xì)胞胞體較大而扁,形狀不規(guī)則,細(xì)胞突起較多較長(zhǎng),呈放射狀。GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿呈棕黃色。 2.37℃缺氧8小時(shí)后,細(xì)胞的形態(tài)、存活力變化不明顯,部分細(xì)胞邊緣皺
4、縮。隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞變化逐漸明顯,細(xì)胞損傷表現(xiàn)明顯加強(qiáng),表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變圓、輪廓不清,突起增粗縮短,細(xì)胞間連接斷裂,逐漸出現(xiàn)細(xì)胞死亡、崩解、胞體漂浮。細(xì)胞存活力下降,呈明顯的時(shí)效關(guān)系。32℃干預(yù)時(shí)大部分細(xì)胞輪廓較清晰,胞周光暈明顯,突起存在,僅有少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)分離現(xiàn)象。細(xì)胞存活力較缺氧/復(fù)氧組增加。 3.細(xì)胞免疫化學(xué)的半定量方法觀察AQP4、AQP5的表達(dá)發(fā)現(xiàn):37℃正常氧供時(shí)AQP4、AQP5位于細(xì)胞膜上的表達(dá)無(wú)明顯變
5、化;37℃缺氧8小時(shí),AQP4陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)減少,AQP5陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)也減少。而復(fù)氧后AQP4、AQP5陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)升高并隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)。與對(duì)照組相比差異有顯著性(p<0.01,p<0.05)。 4.32℃干預(yù)缺氧/復(fù)氧時(shí)AQP4、AQP5陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較37℃缺氧/復(fù)氧組減少(p<0.01,p<0.05)。 [結(jié)論]: 1.星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受能力較強(qiáng),復(fù)氧后細(xì)胞損害隨著時(shí)間延長(zhǎng)明顯
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