IQGAP1在肺炎衣原體感染誘導血管平滑肌細胞粘附和遷移中的作用.pdf

1、目的：
　　利用肺炎衣原體(Chlamdia pneumoniae，C.pn)體外感染大鼠血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)模型，分析C.pn感染對VSMC內(nèi)細胞遷移相關基因表達的影響；觀察C.pn感染對VSMC粘附和遷移能力的影響；探討IQGAP1在C.pn感染誘導VSMC粘附和遷移中的作用。
　　方法：
　　1.C.pn增殖培養(yǎng)后體外感染大鼠VSMC；
　　2.

2、應用基因芯片技術分析C.pn感染大鼠VSMC12h后，VSMC內(nèi)細胞遷移相關基因表達的改變；
　　3.運用MTT法觀察C.pn感染對VSMC粘附能力的影響；
　　4.應用Transwell實驗觀察C.pn感染對VSMC遷移能力的影響；
　　5.利用RT-PCR技術檢測C.pn感染的VSMC內(nèi)IQGAP1 mRNA的表達水平；
　　6.采用Western blot技術檢測C.pn感染的VSMC內(nèi)IQGAP1蛋白的表

3、達水平；
　　7.應用RNA干擾技術使IQGAP1表達水平下調(diào)，RT-PCR技術檢測IQGAP1mRNA的表達，以確定干擾效果；
　　8.運用MTT法觀察RNA干擾下調(diào)IQGAP1基因后對C.pn感染誘導的VSMC粘附的影響；
　　9.應用Transwell實驗觀察RNA干擾沉默IQGAP1表達后對C.pn感染誘導的VSMC遷移的影響。
　　結果：
　　1.C.pn感染組與正常對照組均應用Affymetri

4、x Rat Genome2302.0 Array，通過與大鼠31000個探針進行雜交，分析了31042個轉錄體和變異體，其中包括28000個已知基因。芯片雜交結果通過計算機掃描、定量和分析后，共發(fā)現(xiàn)差異表達基因35個，其中上調(diào)基因12個，下調(diào)基因23個；與細胞遷移密切相關的TLR2基因上調(diào)、TGF-β3和AKAP12基因下調(diào)。基因本體論分析結果顯示，35個差異顯著的基因中，30個基因可以在生物學過程、細胞組成和分子功能中找到注釋，4個基

5、因未搜索到其功能分類；代謝通路分析結果顯示，7個基因參與細胞周期相關的信號通路、補體激活的經(jīng)典途徑相關信號通路、氧化應激相關信號通路和前列腺素合成調(diào)節(jié)相關信號通路；
　　2.C.pn感染VSMC16h后，細胞粘附于Matrigel的能力明顯增強。MTT比色結果顯示，C.pn感染組的吸光度(Absorbance，A)值明顯高于正常對照組(P<0.001)：C.pn感染組的細胞粘附率為162.342％±4.691％(P<0.001)；

6、
　　3.C.pn感染VSMC19h后，C.pn感染組的細胞遷移數(shù)目明顯多于正常對照組(P<0.01)：細胞遷移指數(shù)為152.653％±7.493％(P<0.01)；
　　4.C.pn感染VSMC2h后，IQGAP1條帶亮度與正常對照組差別不大；隨著感染時間延長，IQGAP1條帶亮度逐漸增強；C.pn感染12h時IQGAP1條帶亮度最強；之后，IQGAP1條帶亮度又逐漸減弱，直至感染48h時，條帶亮度與正常對照組基本相同；<

7、br>　　5.Western blot結果顯示，C.pn感染VSMC后，隨著感染時間延長，IQGAP1的表達水平也整體表現(xiàn)出先逐漸升高而后又逐漸降低的趨勢；C.pn感染VSMC16h時IQGAP1的表達水平最高；隨后，IQGAP1的表達水平又逐漸降低；
　　6.重組質(zhì)粒轉染VSMC后24h，熒光顯微鏡下可觀察到pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1Scrambled shRNA轉染組(陰性對照組)和pGPH1/GFP/Neo-I

8、QGAP1 shRNAs轉染組細胞均發(fā)出清晰的綠色熒光，而無質(zhì)粒轉染對照組和正常對照組細胞中則未見有綠色熒光；轉染48h后，各組細胞中的綠色熒光較24h時增強；RT-PCR結果顯示，無質(zhì)粒轉染對照組和陰性對照組細胞內(nèi)IQGAP1 mRNA表達水平與正常對照組無顯著差異；而IQGAP1 mRNA在pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1 shRNA轉染組中的表達水平與正常對照組相比明顯降低；
　　7.經(jīng)MTT比色后發(fā)現(xiàn)，pGPH1/

9、GFP/Neo-IQGAP1 shRNAs轉染組的A值明顯低于對照組(P<0.001)，細胞粘附率為68.543%±1.197％(P<0.001)；陰性對照組細胞粘附于Matrigel的能力與正常對照組相比無明顯變化(p>0.05)；C.pn感染轉染pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1 shRNAs的VSMC后，該組的A值明顯低于C.pn感染組(P<0.001)，其細胞粘附率為104.991%±1.225％(P<0.001)；

10、>　　8.重組質(zhì)粒pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1 shRNAs轉染VSMC后，細胞遷移數(shù)目明顯低于正常對照組(P<0.01)，細胞遷移指數(shù)為69.927％±4.838％(P<0.01)；陰性對照組細胞的遷移數(shù)目與正常對照組相比無明顯差異(P>0.05)；C.pn感染轉染pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1 shRNAs的VSMC后，該組細胞遷移數(shù)目明顯低于C.pn感染組(P<0.01)，細胞遷移指數(shù)為109.553%±4.