乳腺癌轉移抑制基因BRMS1功能的研究.pdf

1、目的：研究乳腺癌轉移抑制基因BRMS1對乳癌細胞生長、增殖、侵襲、轉移以及輻射敏感性的影響以及涉及的相關作用機制，為研究乳癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移和治療提供新的研究方向和實驗依據。
　　 方法：
　　 1、參照GeneBank中BRMS1的基因序列，通過自行設計并擴增得到BRMS1基因cDNA的引物一對，構建了攜帶有全長BRMS1 cDNA的真核表達載體（pcDNA3-BRMS1）；
　　 2、應用陽離子脂質體L

2、ipofactamin2000介導，進行pcDNA3-BRMS1轉染，陽性克隆通過在含G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選得到，并應用RT-PCR和Western Blot法檢測陽性克隆中BRMS1的mRNA和蛋白的表達；
　　 3、應用MTT法分析BRMS1基因轉染對體外培養(yǎng)的乳癌細胞生長、增殖的影響；
　　 4、應用劃痕實驗和Boyden小室法，分析BRMS1基因轉染對體外培養(yǎng)的乳癌細胞侵襲、轉移能力的影響；
　　

3、 5、采用流式細胞術分析BRMS1基因轉染對細胞周期進程和細胞凋亡的影響；
　　 6、采用裸鼠原位接種腫瘤模型，觀察BRMS1基因在體內對乳癌生長、轉移的影響；
　　 7、采用裸鼠尾靜脈接種腫瘤轉移模型觀察BRMS1基因對體內乳癌轉移的影響；
　　 8、通過細胞克隆形成實驗分析BRMS1基因對乳癌細胞輻射敏感性的影響；
　　 9、采用染色體畸變分析、PCC斷片研究BRMS1基因對腫瘤細胞基因組不

4、穩(wěn)定性的影響；
　　 10、采用Western Blot法檢測BRMS1基因對DNA損傷修復相關蛋白表達水平的影響；
　　 11、采用GST-pull down和免疫共沉淀方法檢測BRMS1與核受體直接結合；
　　 12、采用熒光素酶報告基因測定方法測定轉錄活性。
　　 結果：
　　 1、自行構建的BRMS1真核表達載體，經過限制性核酸內切酶BamH I和Xho I酶切后電泳和擴增片斷測序，證實載

5、體構建成功；
　　 2、G418篩選得到的穩(wěn)定陽性克隆，經RT-PCR和Western Blot證實，轉染BRMS1基因可以在乳癌細胞中提高BRMS的表達水平，表明高BRMS1表達的細胞株篩選成功；
　　 3、MTT的結果表明BRMS1對乳癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-435的生長無明顯影響；
　　 4、劃痕實驗結果表明BRMS1基因對乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-435體外遷移能力無

6、明顯影響；
　　 5、Boyden小室實驗結果表明：BRMS1基因轉染細胞的穿越細胞數與未轉染組相比顯著減少（p＜0.05），BRMS1基因轉染細胞的穿越細胞數與空載體組相比也顯著減少（p＜0.05）；
　　 6、流式細胞術分析結果表明：BRMS1基因對乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-435的周期分布及凋亡無明顯改變；
　　 7、裸鼠原位接種腫瘤實驗結果表明：BRMS1基因對裸鼠的體重及腫瘤的生長速

7、度及腫瘤大小無明顯影響；BRMS1基因轉染組的原位腫瘤分化程度較高，而惡性程度偏低；
　　 8、腫瘤轉移模型觀察：未轉染對照組裸鼠有5例明顯的肺轉移，5例出現肝轉移；轉染空載體組裸鼠也出現5例肺轉移,4例肝轉移，而BRMS1轉基因裸鼠組只有1例出現肝轉移。表明體內BRMS1高表達能抑制乳腺癌腫瘤的轉移；
　　 9、腫瘤組織血管實驗：與未轉染組比較，BRMS1轉基因組裸鼠的腫瘤血管數目較少，有顯著統計差異(P<0.05)，

8、表明BRMS1基因能抑制乳腺癌血管生成；
　　 10、克隆形成實驗結果：BRMS1轉染組與未轉染組及空載體組的生存曲線基本一致，表明BRMS1基因不影響腫瘤細胞受照射后的存活率；
　　 11、染色體畸變分析、PCC斷片分析結果：不同劑量的X射線照射后，BRMS1轉染組的染色體畸變率及PCC斷片率低于空載體組與未轉染組；
　　 12、Western Blot法檢測DNA損傷修復相關蛋白表達，BRMS1基因對輻射修復

9、相關蛋白FEN-1、XRCC1和Ku-70的表達無明顯影響；
　　 13、BRMS1可以與雄激素，雌激素等多種核受體蛋白結合，同時作為協同抑制因子抑制AR和ER-a的轉錄活性。
　　 結論：
　　 1、在體外實驗中，BRMS1基因通過降低腫瘤癌細胞的侵襲能力而抑制腫瘤細胞的轉移能力；BRMS1基因不影響乳腺癌細胞MDA-MB-231和MDA-MB-435的增殖能力、遷移和轉移能力；不影響腫瘤細胞的細胞周期分布與凋

10、亡；
　　 2、BRMS1基因不影響裸鼠原位移植腫瘤的形成及腫瘤細胞本身的生長；BRMS1基因通過抑制移植腫瘤的血管生成及促進體內移植腫瘤的分化，從而降低腫瘤的惡性程度，抑制裸鼠移植腫瘤的遠處轉移；
　　 3、BRMS1基因對腫瘤細胞受照射后的存活率無明顯影響；不影響腫瘤細胞受照前后相關輻射損傷修復蛋白的表達。BRMS1基因通過降低腫瘤細胞的基因組不穩(wěn)定性而在一定程度上降低了腫瘤細胞的放射敏感性；
　　 4、BR