CSN復合物在ATRA誘導APL細胞分化中的作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　全反式維甲酸（ATRA）是第一個成功應用于白血病治療的誘導分化藥物，能夠通過降解PML-RARα融合蛋白特異性誘導急性早幼粒細胞白血病（APL）細胞分化成熟，因此已成為臨床上治療APL的首選藥物。但至今為止，ATRA誘導細胞分化的作用機制仍未得到系統(tǒng)闡述。根據現有文獻報道，維甲酸誘導基因G（RIG-G）可與COP9信號復合體（CSN）亞基CSN5相互作用，導致CSN復合物破壞并抑制其功能，提示CSN可能參與ATRA誘導

2、的細胞分化；但是，其相關性研究仍未見報道。因此，本研究將重點研究CSN在ATRA誘導APL細胞分化過程中的作用，并探討其可能的作用機制。具體研究內容分為三個部分：1）闡明CSN在ATRA誘導APL細胞分化過程中的變化情況；2）研究ATRA誘導分化中CSN-CRLs信號通路的變化；3）探討CSN-CRLs信號通路調控PML-RARα自噬降解的分子機制。
　　方法：
　　1）選用人白血病細胞株NB4細胞為研究對象，以ATRA處理

3、來考察ATRA誘導細胞分化過程中CSN的表達情況：應用吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)學改變；細胞經CD11b抗體孵育后采用流式細胞術檢測細胞表面分化抗原CD11b表達；應用RT-PCR檢測細胞中CSN各亞基mRNA水平變化；應用Western blot檢測CSN蛋白水平的變化。同時應用RT-PCR檢測11例APL初診患者和15例非血液疾病患者骨髓細胞中CSN3和CSN5的表達情況。
　　2）選用人白血病細胞株NB4細胞為研究對象，采用We

4、stern blot檢測ATRA誘導細胞分化過程中CSN-CRLs信號通路中CRLs支架蛋白cullin蛋白、底物識別蛋白及下游靶蛋白DEPTOR、DAPK1等的表達情況。
　　3）選用人白血病細胞株NB4細胞為研究對象，應用Western blot和免疫熒光法檢測ATRA誘導分化中細胞內自噬水平變化；選用293T細胞為瞬時表達宿主，共轉染DAPK1和PML-RARα，通過Western blot檢測分析DAPK1對PML-RAR

5、α蛋白的影響；分別以蛋白酶體抑制劑MG132和自噬抑制劑3-MA處理細胞進一步比較觀察PML-RARα蛋白表達情況。
　　結果：
　　1）吉姆薩染色結果表明ATRA作用72小時后，NB4細胞分化為成熟粒細胞。同時，經流式細胞術檢測細胞分化特異性抗原CD11b的表達，結果顯示ATRA能夠誘導NB4細胞發(fā)生分化，且呈時間依賴性變化。Western blot及RT-PCR等檢測結果顯示，ATRA作用后，CSN復合物及各亞基表達水平

6、均明顯下調，且與細胞分化進程相一致。此外，通過RT-PCR對臨床患者進行檢測，結果發(fā)現CSN3和CSN5在APL患者骨髓中的含量明顯高于非白血病患者；經ATRA化療緩解后，APL患者的CSN3和CSN5的mRNA表達水平均明顯下降。進一步提示ATRA可以抑制CSN復合物的表達。
　　2）鑒于CSN復合物在泛素蛋白酶體調節(jié)中的重要作用，進一步檢測CSN-CRLs信號通路中相關蛋白的變化。Western blot檢測結果顯示，ATRA

7、作用后，NB4細胞中CRLs支架蛋白cullin1和cullin3蛋白及其底物識別蛋白Skp2、βTrCP與KLHL20的表達都顯著下降；同時，其下游靶蛋白DEPTOR、p27與DAPK1表達明顯上調。這些結果表明CSN-CRLs-E3信號通路可能在APL發(fā)病以及ATRA誘導分化中發(fā)揮重要作用。
　　3）由于DEPTOR、DAPK1等蛋白分子在細胞自噬調控中發(fā)揮著重要作用，而研究發(fā)現分化誘導劑 ATRA可以增強 APL細胞的自噬水

8、平，并能促進PML/RARα蛋白降解。為了探討DAPK1等蛋白的累積是否與ATRA誘導的PML/RARα蛋白的自噬降解有關，采用脂質體共轉染PML/RARα和DAPK1至293T細胞，通過Western blot檢測，結果顯示DAPK1的過表達可促進PML/RARα蛋白的降解以及增強細胞自噬；在加入自噬抑制劑3-MA后，細胞自噬水平下降，同時DAPK1介導的PML/RARα蛋白降解作用明顯減弱，提示DAPK1可以促進PML/RARα蛋白

9、的降解，很可能與其介導的細胞自噬有關。
　　結論：
　　通過本課題的研究，首先，我們發(fā)現CSN在APL患者及NB4細胞株中呈高表達；而在ATRA作用后CSN的表達水平明顯下調。其次，ATRA通過調節(jié)CSN-CRLs信號通路導致其下游靶蛋白DEPTOR、DAPK1等表達增加，而DAPK1可以促進PML/RARα融合蛋白的自噬降解。本研究較系統(tǒng)地探討了CSN在ATRA誘導APL細胞分化中的作用及其相關機制，為進一步完善與發(fā)現新的