DJ-1促胃癌細胞侵襲遷移及其機制的研究.pdf

1、胃癌是我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一,侵襲和轉(zhuǎn)移是導致死亡的主要因素,也是影響胃癌臨床整體治療水平的關(guān)鍵因素。因此深入探討胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移機制,尋找胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白分子,對胃癌的治療及預后具有重要的意義。
　　DJ-l蛋白是1997年首次報道的一種絲裂原依賴性癌基因產(chǎn)物,該蛋白高度保守、廣泛表達于機體各組織細胞,并以同源二聚體的形式參與細胞多種病理生理活動,如基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、抗氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡、“分子伴侶”及促細胞生

2、長增殖等。近年來,隨著研究的深入,越來越多的研究表明DJ-1與腫瘤密切相關(guān),在許多腫瘤的發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中可能起重要作用,但DJ-1在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用未見報道。
　　眾所周知,胃癌侵襲轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多基因參與的復雜序貫過程。其中,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2和MMP-9所介導的細胞基底膜及外基質(zhì)降解破壞至關(guān)重要,被認為是胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的必要步驟。目前研究已證實,胃癌侵襲轉(zhuǎn)移

3、中MMP-2與MMP-9蛋白表達的調(diào)控涉及Akt信號通路。然而,值得關(guān)注的是,最近研究表明DJ-1可能是Akt信號通路的一個重要的正性調(diào)控蛋白。據(jù)此,我們假設(shè):DJ-1可能參與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移,其機制可能通過激活Akt信號通路,進而上調(diào)MMP-2、MMP-9的表達,促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　為此,本研究擬從細胞水平,應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染及RNA干擾等分子生物學手段,通過體外侵襲和遷移實驗?zāi)Ｐ?觀察DJ-1不同表達水平對胃癌細胞侵襲遷移能力

4、的影響,以求闡明DJ-1是否參與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移;同時,從Akt信號通路及細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9表達改變的角度進一步探討DJ-1促胃癌細胞侵襲遷移的分子機制。該研究將為在整體水平上進一步探討DJ-1在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中的作用提供線索,同時也為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的防治提供新思路和新的干預環(huán)節(jié)。
　　第一部分:DJ-1不同表達水平對胃癌細胞侵襲遷移的影響
　　目的:
　　應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染及RNA干擾等分子生物學手段,通過體外侵襲和遷移

5、實驗?zāi)Ｐ?觀察DJ-1不同表達水平對胃癌細胞侵襲遷移能力的影響,在細胞水平以求闡明DJ-1是否參與胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　方法:
　　1.設(shè)計3條靶向人源DJ-1基因的候選RNA干擾序列,并利用shRNA真核表達載體pGPU6/GFP/Neo構(gòu)建重組質(zhì)粒;同時設(shè)計并構(gòu)建陰性對照RNA干擾重組載體,用于鑒定pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒介導的RNA干擾體系的特異性;
　　2.經(jīng)DNA測序確認后,將構(gòu)建成功的各重組shRN

6、A表達載體利用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細胞,轉(zhuǎn)染24h后,RT-PCR和Western Blot檢測DJ-1 mRNA和蛋白表達情況,并篩選出最佳抑制效率的重組shRNA表達質(zhì)粒;
　　3.將篩選出的抑制DJ-1表達最有效的重組shRNA表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細胞,同時穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陰性對照的干擾質(zhì)粒作為對照,經(jīng)新霉素抗性篩選、加壓培養(yǎng)建系后,RT-PCR及Western blot檢測所篩選細胞中DJ-1 mRNA和

7、蛋白的表達;
　　4.經(jīng)Blast驗證,大鼠DJ-1 mRNA序列與我們所設(shè)計的人DJ-1 siRNA序列不存在完全配對,因此,為了進行DJ-1干擾回復實驗及DJ-1過表達實驗。我們利用pFLAG-CMV-4真核表達載體,構(gòu)建耐人DJ-1 siRNA的鼠源性DJ-1過表達重組載體pFLAG-rDJ-1,經(jīng)DNA測序確認后用于后續(xù)實驗;
　　5.pFLAG-rDJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒pFLAG分別瞬時轉(zhuǎn)染空白對照的SGC7

8、901胃癌細胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陰性對照細胞SGC7901/NC-siRNA和DJ-1低表達的胃癌細胞系SGC7901/DJ-1-siRNA,轉(zhuǎn)染24h后,通過Western Blot法檢測DJ-1蛋白表達變化;采用MTT法檢測細胞增殖情況;Transwell小室測定細胞的遷移和侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1. DNA測序鑒定證實,各重組shRNA表達載體包括陰性對照載體pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA及靶向DJ

9、-1的3個重組載體pGPU6/GFP/Neo-DJ-1-shRNA1,2,3均構(gòu)建成功。
　　2.各重組shRNA真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染SGC7901細胞后,經(jīng)RT-PCR檢測,陰性對照載體pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA對DJ-1 mRNA表達無明顯影響,而靶向DJ-1的3個重組shRNA表達載體pGPU6/GFP/Neo-DJ-1-shRNA1,2,3對DJ-1 mRNA表達的抑制率分別為40％,45%,78%;經(jīng)W

10、estern blot檢測,陰性對照載體pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA對DJ-1蛋白表達也無顯著影響,而靶向DJ-1的3個重組shRNA表達載體pGPU6/GFP/Neo-DJ-1-shRNA1,2,3對DJ-1蛋白表達的抑制率分別為34%,41%,76%;與空白對照的 SGC7901細胞相比較,pGPU6/GFP/Neo-DJ-1-shRNA3重組載體抑制DJ-1表達的效應(yīng)最佳,有顯著性差異(P<0.05)。
　　

11、3.經(jīng)RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn):與空白對照的SGC7901細胞相比較,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-DJ-1-shRNA3重組載體的SGC7901細胞系(命名為SGC7901/DJ-1-siRNA)中DJ-1 mRNA和蛋白的表達明顯下調(diào),分別下調(diào)了77%和75%;而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA的SGC7901細胞系(命名為SGC7901/NC-siRNA)中DJ-1 mRNA及蛋白的

12、表達無明顯變化(P>0.05)。
　　4.經(jīng)DNA測序鑒定證實,DJ-1真核表達重組質(zhì)粒pFLAG-rDJ-1構(gòu)建成功。
　　5.與空白對照的SGC7901細胞相比較,陰性對照的SGC7901/NC-siRNA細胞中DJ-1蛋白表達、細胞侵襲力、細胞遷移力均無顯著差異(均P>0.05),然而在SGC7901/DJ-1-siRNA細胞,DJ-1蛋白表達明顯下調(diào)、細胞侵襲和細胞遷移力顯著降低(均P<0.05)。更為重要的是,SG

13、C7901/DJ-1-siRNA細胞經(jīng)pFLAG-rDJ-1轉(zhuǎn)染后,DJ-1蛋白表達恢復,同時伴隨細胞侵襲、遷移力的恢復;此外,SGC7901細胞及SGC7901/NC-siRNA細胞經(jīng)pFLAG-rDJ-1轉(zhuǎn)染后,DJ-1蛋白表達、細胞侵襲、遷移力均明顯增加(均P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建3個靶向DJ-1基因的重組shRNA真核表達載體pGPU6/GFP/Neo-DJ-1-shRNA1,2,3,該3個重組

14、載體均可有效抑制SGC7901細胞中DJ-1的表達,其中pGPU6/GFP/Neo-DJ-1-shRNA3抑制效果最強;
　　2.成功建立了DJ-1低表達的SGC7901胃癌細胞系,即SGC7901/DJ-1-siRNA細胞,為后續(xù)研究打下了基礎(chǔ);
　　3.成功構(gòu)建DJ-1真核表達重組質(zhì)粒pFLAG-rDJ-1,為RNA干擾回復實驗奠定了基礎(chǔ);
　　4.在細胞水平證實,DJ-1蛋白能促進胃癌細胞侵襲遷移。
　　第

15、二部分:DJ-1促胃癌細胞侵襲遷移分子機制的初步探討
　　目的:
　　利用DJ-1低表達的SGC7901胃癌細胞系,結(jié)合pFLAG-rDJ-1轉(zhuǎn)染及Akt和MPP-2,9抑制劑的干預,從Akt信號通路及細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9表達改變的角度初步探討DJ-1促胃癌細胞侵襲遷移的分子機制。
　　方法:
　　1.利用SGC7901細胞、SGC7901/NC-siRNA以及SGC7901/DJ-1-siRNA細胞,分

16、別經(jīng)pFLAG-rDJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒pFLAG瞬時轉(zhuǎn)染24h后,通過Western Blot法分別檢測Akt、磷酸化Akt、MMP-2以及MMP-9蛋白表達變化。
　　2.利用SGC7901細胞、SGC7901/NC-siRNA以及SGC7901/DJ-1-siRNA細胞,分別經(jīng)pFLAG-rDJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒pFLAG瞬時轉(zhuǎn)染24h后,各組細胞分別用5μM MMP-2/MMP-9抑制劑(MMP-2/MMP-9

17、 inhibitor I)或0.1%DMSO處理2h,隨后通過Transwell小室測定細胞的遷移和侵襲能力的變化。
　　3.SGC7901細胞分別經(jīng)20μM Akt抑制劑API-2和0.1%(v:v) DMSO處理24h后,Western Blot檢測Akt、磷酸化Akt、MMP-2以及MMP-9蛋白表達變化;Transwell小室測定細胞的遷移和侵襲能力的變化。
　　4.SGC7901/DJ-1-siRNA細胞,經(jīng)pFL

18、AG-rDJ-1重組載體或?qū)φ湛召|(zhì)粒pFLAG瞬時轉(zhuǎn)染24h后,分別用20μM Akt抑制劑API-2和0.1%(v:v)DMSO處理24h,隨后Western Blot檢測Akt、磷酸化Akt、MMP-2以及MMP-9蛋白表達變化;Transwell小室測定細胞的遷移和侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.與空白對照的SGC7901細胞相比較,DJ-1沉默的SGC7901/DJ-1-siRNA細胞內(nèi)磷酸化Akt、MMP-2

19、及MMP-9蛋白表達水平明顯降低(均P<0.05),而這些效應(yīng)在pFLAG-rDJ-1轉(zhuǎn)染后均可被DJ-1表達恢復所逆轉(zhuǎn)。此外,SGC7901細胞及SGC7901/NC-siRNA細胞經(jīng)pFLAG-rDJ-1轉(zhuǎn)染后,磷酸化Akt、MMP-2及MMP-9蛋白表達水平均明顯增加(均P<0.05)。
　　2.SGC7901細胞經(jīng)MMP-2/MMP-9 inhibitor I處理后,細胞侵襲、遷移能力下降;此外,MMP-2/MMP-9 i

20、nhibitor I取消pFLAG-rDJ-1轉(zhuǎn)染SGC7901細胞所引起的細胞侵襲、遷移力增加效應(yīng),同時也逆轉(zhuǎn)pFLAG-rDJ-1轉(zhuǎn)染SGC7901/DJ-1-siRNA細胞所引起的細胞侵襲、遷移能力恢復的效應(yīng)。
　　3.SGC7901細胞經(jīng)Akt抑制劑API-2處理后,磷酸化Akt、MMP-2及MMP-9蛋白表達水平均明顯下調(diào),同時細胞侵襲、遷移能力降低。
　　4.SGC7901/DJ-1-siRNA細胞經(jīng)pFLAG-