姜黃素通過激活PPARγ抑制大腸癌細胞的增殖.pdf

1、目的： 大腸癌是一種發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，其發(fā)病率還有不斷增高的趨勢。姜黃素作為天然植物成分，幾乎無毒副作用，既往研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制DMH誘導(dǎo)的大鼠大腸癌細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡，具有預(yù)防大腸癌發(fā)生的作用[1，2]，但其抗腫瘤作用的分子機制尚不十分清楚。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）為配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子，被配體激活后與維甲酸X受體（RXR）結(jié)合形成異源二聚體，再與DNA上PPAR反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控下

2、游靶基因包括COX-2，NF-кB等的表達，進而通過多級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)糖脂代謝以及細胞增殖、分化和凋亡等。本研究旨在研究姜黃素對大鼠大腸組織及人結(jié)腸癌HT29細胞株過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）表達的影響，深入探討姜黃素在防治結(jié)腸腫瘤發(fā)生的分子機制。 方法： 1.模型建立：利用DMH誘導(dǎo)大鼠大腸癌模型，80只大鼠統(tǒng)一編號，隨機分成3組：①陰性對照組（20只）：標準固體飼料+皮下注射與DMH等體積的生理鹽水。

3、②陽性對照組（30只）：標準固體飼料+DMH。③姜黃素組（30只）：含0.2％姜黃素的固體飼料+DMH。實驗第12周每組處死5只，32周處死所有存活大鼠，評價藥物對大鼠大腸癌的防治效果并初步探討其預(yù)防機制。 2、細胞培養(yǎng)：人結(jié)腸癌細胞株HT29購于中科院上海細胞所，細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清，100μ/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃，CO2濃度為5％，根據(jù)細胞生長情況，每2～3

4、d用0.25％的胰酶消化，進行傳代培養(yǎng)。將細胞分為3組：對照組、姜黃素加GW9662組、姜黃素組。 3.MTT實驗檢測細胞生長狀態(tài)取處于對數(shù)生長期的HT29細胞進行實驗。將細胞按1×104/孔密度接種于96孔板，每孔100μl，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。姜黃素和GW9662均以DMSO溶解，用細胞培養(yǎng)液稀釋至不同濃度加于細胞，同時設(shè)陰性對照組、空白對照。每組設(shè)三個復(fù)孔。GW9662提前30min加入。加藥培養(yǎng)12h，24h，

5、48h，72h后，每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，37℃繼續(xù)孵育4h。吸去上清液，每孔加入DMSO200μl，震蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標儀在570nm波長處測定光吸收值。按公式計算細胞存活率=A實驗孔/A對照孔×100％。 4.利用免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡（Westernblotting）方法分別檢測各實驗組大鼠大腸癌組織PPARγ和COX-2的表達。 結(jié)果： 1.體內(nèi)實驗： 1.1

6、姜黃素對DMH誘導(dǎo)大鼠大腸癌的影響：姜黃素能有效降低DMH誘導(dǎo)的大鼠大腸癌的發(fā)生，姜黃素組荷瘤鼠的數(shù)量及大腸腫瘤的發(fā)生率明顯低于陽性對照組（P<0.01）。姜黃素對DMH誘導(dǎo)大鼠大腸癌的抑制率為46.46％。姜黃素組大鼠大腸腫瘤的平均數(shù)量和平均體積也明顯低于陽性對照組。 1.2免疫組化檢測PPARγ和COX-2的表達：免疫組化結(jié)果顯示陰性對照組大鼠大腸組織PPARγ呈較弱表達，DMH誘導(dǎo)大鼠組織腸上皮細胞PPARγ表達增強，可見

7、棕黃色顆粒。與陽性對照組相比，姜黃素組PPARγ表達顯著增強，主要集中于細胞核部位。COX-2免疫組化結(jié)果顯示DMH誘導(dǎo)大鼠組織大腸癌細胞COX-2表達增強，可見細胞漿棕黃色染色。與陽性對照組相比，姜黃素組COX-2表達較弱。 1.3姜黃素對大鼠大腸癌變過程中PPARγ和COX-2蛋白表達的影響：誘癌32W時陽性對照組及姜黃素組大腸癌組織PPARγ蛋白表達均明顯高于陰性對照組（P<0.01）。與陽性對照組相比，姜黃素組PPARγ

8、表達增強（P<0.05）。 2.體外實驗： 2.1姜黃素對HT29細胞增殖的影響：利用MTT法檢測不同濃度姜黃素對細胞增殖的影響，結(jié)果表明姜黃素可以抑制體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細胞株HT29的增殖，且呈劑量和時間依賴性，隨藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用逐漸增強。而同時加入PPARγ的特異性抑制劑GW9662時，則姜黃素對細胞的抑制作用減弱。 2.2姜黃素對HT29細胞PPARγ和COX-2表達的影響：West

9、ernblotting結(jié)果顯示：姜黃素處理組結(jié)腸癌HT29細胞PPARγ的表達增強，與對照組相比差異顯著（P<0.01）。應(yīng)用PPARγ特異性阻斷劑GW9662能夠部分阻斷姜黃素對HT29細胞PPARγ，表達的上調(diào)作用（P<0.05）。同時結(jié)果還表明，與對照組相比，姜黃素處理后HT29細胞COX-2蛋白表達明顯下降（P<0.01），這種作用可以被PPARγ特異性阻斷劑GW9662所抑制（P<0.01）。 結(jié)論： 1.姜黃