抗TfR人-鼠嵌合抗體桿狀病毒共表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建抗人TfR人/鼠嵌合抗體昆蟲桿狀病毒共表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)基因工程抗體，以及開展以TfR為靶點(diǎn)的腫瘤免疫顯像與治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　通過PCR技術(shù)分別擴(kuò)增抗TfR人/鼠嵌合抗體的輕鏈和重鏈V區(qū)；通過基因工程技術(shù)構(gòu)建抗TfR人/鼠嵌合抗體蛋白二聚體的重組桿狀病毒Bacmid共表達(dá)載體，并進(jìn)行表達(dá)；采用M13F/M13R特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證后，感染Sf9昆蟲

2、細(xì)胞，收獲病毒滴度較高的重組桿粒再次感染Sf9昆蟲細(xì)胞以獲得濃度較高的目的蛋白；表達(dá)產(chǎn)物通過ELISA方法檢測(cè)濃度并濃縮純化；SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物；Western blotting檢測(cè)嵌合抗體與TfR蛋白的結(jié)合活性；FCM檢測(cè)嵌合抗體與多株腫瘤細(xì)胞表面TfR特異性結(jié)合的能力。
　　結(jié)果：
　　PCR擴(kuò)增出的抗TfR人/鼠嵌合抗體的輕鏈和重鏈V區(qū)基因片段經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其片段大小與理論值相符，經(jīng)測(cè)序鑒定顯示其

3、DNA序列完全正確。重組桿狀病毒經(jīng)PCR擴(kuò)增顯示其產(chǎn)物片段大小與理論值相符。ELISA檢測(cè)顯示在感染后的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清中有大量抗體表達(dá)。收集培養(yǎng)上清經(jīng)濃縮純化后，SDS-PAGE和Western blotting鑒定顯示表達(dá)產(chǎn)物具有嵌合抗體重鏈和輕鏈條帶，且分子量大小正確。Western blotting檢測(cè)顯示表達(dá)產(chǎn)物能夠與TfR蛋白結(jié)合，但FCM檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物嵌合抗體分子與細(xì)胞表面TfR+的腫瘤細(xì)胞結(jié)合率較低，與空白對(duì)照比較幾乎無

4、明顯差異。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了表達(dá)抗TfR人/鼠嵌合抗體的重組桿粒BacmidTM+[H/L]共表達(dá)載體，通過感染Sf9昆蟲細(xì)胞后能夠表達(dá)完整的嵌合抗體分子，Western blotting檢測(cè)顯示表達(dá)產(chǎn)物能夠與TfR蛋白結(jié)合，但FCM檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞表面TfR+腫瘤細(xì)胞結(jié)合率與空白對(duì)照比較無明顯差異，分析其原因可能由于表達(dá)量低，或者VL區(qū)極少數(shù)堿基突變所致，因此對(duì)該載體系統(tǒng)的表達(dá)量及其表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞表面天然受體