部分遺傳性出血性疾病的分子發(fā)病機(jī)制研究及凝血酶生成試驗(yàn)的應(yīng)用.pdf

1、遺傳性凝血因子X缺陷癥是一種罕見的出血性疾病，有研究表明患者血漿中的凝血因子X活性（FX:C）與其臨床癥狀間的相關(guān)性較弱。凝血酶生成試驗(yàn)可從整體水平評(píng)估個(gè)體出血傾向的試驗(yàn)。本研究對(duì)四例遺傳性凝血因子X缺陷癥家系進(jìn)行了完整的表型診斷及基因診斷，同時(shí)檢測(cè)了四條途徑激活的FX:C及FX的抗原水平（FX:Ag）。采用標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程分別檢測(cè)凝血因子X缺陷癥患者血漿在1 pM組織因子及5 pM組織因子激活下的凝血酶生成能力，并研究玉米胰蛋白酶抑制

2、劑（corn trypsin inhib itor，CTI）在抑制體外接觸激活后對(duì)兩種組織因子濃度激活下的凝血酶生成的影響。先證者3屬于Ⅲ型FX缺陷，其基于各途徑的FX:C分別為6.2％、1.2%、1.0%和13.6%，其余三例先證者均為Ⅰ型F X缺陷。結(jié)果表明，無(wú)論對(duì)于正常人血漿標(biāo)本還是凝血因子X缺陷癥患者血漿標(biāo)本，凝血酶生成試驗(yàn)在1 pM組織因子激活時(shí)需要加入CTI以消除體外接觸激活對(duì)標(biāo)本凝血酶生成測(cè)定的影響，在5 pM組織因子激活

3、時(shí)體外接觸激活對(duì)凝血酶生成試驗(yàn)的影響則并不顯著。1 pM組織因子激活下的凝血酶生成潛力（ETP）、峰值（Peak）及凝血酶生成速率（Rate）等指標(biāo)與凝血因子X缺陷癥患者血漿FX:C水平及臨床表型嚴(yán)重程度均存在良好的相關(guān)性且比5 pM組織因子激活時(shí)更敏感。因此，我們推薦使用接觸激活抑制劑（CTI），采用1 pM組織因子激活的凝血酶生成試驗(yàn)以評(píng)估凝血因子X缺陷癥患者出血傾向。
　　血友病A（haemophilia A，HA）為臨床上

4、最常見的遺傳性出血性疾病，本研究對(duì)6例剪切位點(diǎn)相關(guān)突變HA患者進(jìn)行了表型診斷和基因診斷，并明確了其分子發(fā)病機(jī)制。通過剪切位點(diǎn)分析軟件NNS plic e（www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html）以及Alamut2.3預(yù)測(cè)突變對(duì)mRNA剪接的影響。同時(shí)進(jìn)行體內(nèi)外周血mRNA水平異位轉(zhuǎn)錄檢測(cè)患者F8基因mR NA轉(zhuǎn)錄水平，并構(gòu)建小基因體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以研究6種剪切位點(diǎn)突變的分子發(fā)病機(jī)制并評(píng)估軟件預(yù)測(cè)

5、結(jié)果的準(zhǔn)確性。先證者1、2、3體內(nèi)異位轉(zhuǎn)錄均檢測(cè)到兩種異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，先證者4、5、6只檢測(cè)到了1種異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。先證者1突變（c.599_601+2delAAGGT）導(dǎo)致了4號(hào)外顯子及4、5號(hào)外顯子的聯(lián)合缺失。先證者2為c.1444-8_1444d elAC T T T C AG A突變，其中一種異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物缺失了10號(hào)外顯子，另外，野生型剪切位點(diǎn)下游12個(gè)堿基處（c.1456）產(chǎn)生了新的剪切位點(diǎn)。先證者3為c.1903+5G>A突變，

6、其中一種異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物缺少了10號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、13號(hào)4個(gè)外顯子序列，同時(shí)，在野生型剪切位點(diǎn)下游86 bp處產(chǎn)生了新的剪切位點(diǎn)。先證者4（c.5586+3A>T）、5（c.6115+1G>A）、6（c.6187+1delG）的突變則分別導(dǎo)致了F8基因16號(hào)、19號(hào)、20號(hào)外顯子的丟失。本研究中6種剪切位點(diǎn)相關(guān)突變的致病性與軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果相符，但對(duì)于候選剪切位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，軟件分析的結(jié)果卻不一定可靠。3種小基因體外表達(dá)的結(jié)果與先證者4、5、

7、6體內(nèi)異位轉(zhuǎn)錄結(jié)果完全一致。本研究從mRNA水平明確了6例剪切位點(diǎn)相關(guān)突變的分子發(fā)病機(jī)制，軟件分析及小基因體外表達(dá)的方法是預(yù)測(cè)剪切位點(diǎn)相關(guān)突變致病性較好的輔助手段。
　　經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在本院近四年所檢測(cè)的343個(gè)HA家系中，發(fā)生于F8基因14號(hào)外顯子p o ly A區(qū)的缺失或插入A突變共32例，占總HA家系的9.33%，占小片段缺失或插入突變的42.11%，為HA熱點(diǎn)突變。這些家系中多數(shù)為散發(fā)（21例），無(wú)血友病家族史，其中又有10名先