油菜花藥發(fā)育相關(guān)基因BnCYP704B1順反作用因子的研究.pdf

1、BnCYP704B1基因是甘藍型油菜隱性核不育兩系型S45AB的育性恢復(fù)基因。研究表明，該基因顯著表達于花藥發(fā)育四分體時期絨氈層結(jié)構(gòu)，編碼中長鏈脂肪酸羥化酶，參與絨氈層形成和PCD過程中的脂類代謝。該基因表達具有顯著的時空特異性。本研究旨在利用啟動子表達分析和酵母單雜交技術(shù)尋找該基因上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，豐富和完善油菜花藥發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.油菜BnCYP704B1核心啟動子的發(fā)現(xiàn)
　　擴增油菜BnC

2、YP704B1起始密碼子上游1085bp為啟動子區(qū)段。并根據(jù)生物信息學預(yù)測對該區(qū)段以616、466、340、203、101和80bp長度進行5'端截短，分別命名Pms1616、Pms1466、Pms1340、Pms1203、Pms1101、Pms180，對重組載體和空載對照Pck以農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，對獲得的陽性轉(zhuǎn)基因植株花蕾進行GUS組織化學染色。染色結(jié)果顯示:Pms1616、Pms1466、Pms1340、Pms1

3、203缺失載體花蕾中存在GUS基因的藍色信號。Pms1101、Pms180缺失載體和空載對照Pck花蕾中均無GUS信號。以此推測，在起始密碼子上游-203bp～-101bp區(qū)段存在驅(qū)動BnCYP704B1在花藥中表達的順式作用元件。
　　2.油菜BnCYP704B1調(diào)控基因的挖掘
　　用上述順式作用元件構(gòu)建酵母單雜交誘餌載體Pro45-AbAi，通過誘餌菌株自激活濃度測定，確定AbA濃度為100ng/mL時可有效抑制菌株的自

4、激活該效應(yīng)。以該濃度篩選油菜花蕾cDNA文庫，篩得到三個完整的MYB類轉(zhuǎn)錄因子。在油菜中克隆上述基因，DNA-蛋白質(zhì)點對點實驗證明得這些基因與P45-AbAi相互作用。
　　3.調(diào)控基因的遺傳學驗證
　　在擬南芥數(shù)據(jù)庫中同源比對得這三個轉(zhuǎn)錄因子的同源基因為at4g17695(KAN3)、at3g12730、at4g13640(PHR3)。挑選這些基因的T-DNA插入突變體和激活標簽突變體。根據(jù)載體序列設(shè)計特異性引物PCR鑒定