廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)主要流行于太平洋島嶼和東南亞地區(qū)如泰國(guó)、越南、馬來(lái)西亞、日本、印度、菲律賓等國(guó)家。近年來(lái)，該蟲(chóng)的感染呈擴(kuò)散趨勢(shì)，不斷有新的疫區(qū)出現(xiàn)，此外如瑞士、美國(guó)、澳大利亞等國(guó)家也有感染病例的報(bào)道。到目前為止，全球已有超過(guò)3000例人體病例的報(bào)道，其重要性已經(jīng)引起了醫(yī)學(xué)界的重視。廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)主要侵犯人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎或腦膜炎（EM）。一個(gè)良好的動(dòng)物模型對(duì)于了解寄生蟲(chóng)的致病機(jī)理、宿主的抗感染免疫、疾病的實(shí)驗(yàn)室診

2、斷和藥物篩選研究至關(guān)重要。目前，廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)感染在體實(shí)驗(yàn)研究多是選用大鼠或小鼠，但它們作為感染模型動(dòng)物自身都存在一定的局限性，且不能正確反映兒童和免疫力較低下人群感染后廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的發(fā)育過(guò)程和人體組織病變特點(diǎn)，所以有開(kāi)發(fā)一種新的動(dòng)物模型用于廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)感染研究的需要。長(zhǎng)爪沙鼠作為一種小型“多功能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物”，具有經(jīng)濟(jì)、使用方便、易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛的被用作多種寄生蟲(chóng)感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。因此，本研究對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠作為廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)感染模型

3、動(dòng)物的可能性進(jìn)行了探討。
　　研究目的：以廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)第Ⅲ期幼蟲(chóng)感染的長(zhǎng)爪沙鼠為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)該蟲(chóng)在長(zhǎng)爪沙鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育、組織分布、病理改變、血清特異性IgG抗體水平的動(dòng)態(tài)變化和抗蠕蟲(chóng)藥物治療效果等方面的研究，以探討其作為廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)新的感染動(dòng)物模型的可能性和特點(diǎn)。
　　研究方法：
　　1、從褐云瑪瑙螺中分離和獲取廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)第Ⅲ期幼蟲(chóng)。
　　2、動(dòng)物感染
　　①將長(zhǎng)爪沙鼠隨機(jī)分為3組，包括感染組1、感

4、染組2和感染組3。每組各20只長(zhǎng)爪沙鼠，3組經(jīng)腹腔注射感染廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)第Ⅲ期幼蟲(chóng)，感染蟲(chóng)體數(shù)分別為：35條幼蟲(chóng)/鼠、15條幼蟲(chóng)/鼠、10條幼蟲(chóng)/鼠。另設(shè)未感染的長(zhǎng)爪沙鼠20只作為對(duì)照。觀(guān)察至感染后第32 d。
　?、趯㈤L(zhǎng)爪沙鼠分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組20只長(zhǎng)爪沙鼠，實(shí)驗(yàn)組50只長(zhǎng)爪沙鼠。其中對(duì)照組經(jīng)腹腔注射生理鹽水；實(shí)驗(yàn)組經(jīng)腹腔注射感染廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)第Ⅲ期幼蟲(chóng)，10條幼蟲(chóng)/鼠。觀(guān)察至感染后第46 d。
　?、蹖V州管圓線(xiàn)蟲(chóng)第

5、Ⅲ期幼蟲(chóng)經(jīng)腹腔注射感染24只長(zhǎng)爪沙鼠，15條幼蟲(chóng)/鼠。于感染后第7 d將感染長(zhǎng)爪沙鼠隨機(jī)分成未治療組和治療組（阿苯達(dá)唑），每組均為12只長(zhǎng)爪沙鼠。
　　3、對(duì)感染敏感性的觀(guān)察觀(guān)察感染后各組長(zhǎng)爪沙鼠的生理學(xué)變化和病理學(xué)改變；記錄各組長(zhǎng)爪沙鼠的存活及死亡情況，以了解長(zhǎng)爪沙鼠對(duì)廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)感染的敏感性、耐受性和適宜的實(shí)驗(yàn)感染蟲(chóng)數(shù)。
　　4、實(shí)驗(yàn)組感染情況的觀(guān)察
　?、僖话阈袨楹退劳銮闆r的觀(guān)察按上述方法3進(jìn)行。
　?、谑?/p>

6、體內(nèi)蟲(chóng)體的檢查、蟲(chóng)體的組織分布和形態(tài)觀(guān)察分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)剖殺部分實(shí)驗(yàn)組的長(zhǎng)爪沙鼠，檢查在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡的感染長(zhǎng)爪沙鼠；在第46 d剖殺對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組存活的長(zhǎng)爪沙鼠。除少部分鼠的腦、肺組織用于直接固定和病理切片檢查外，對(duì)其余長(zhǎng)爪沙鼠分離的腦和肺組織，撕碎后用肉眼或顯微鏡查找廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)體。記錄各組織中所檢獲的雌雄蟲(chóng)體數(shù)量，并測(cè)量蟲(chóng)體大小和觀(guān)察蟲(chóng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　?、劢M織病理變化觀(guān)察檢查感染后不同時(shí)間長(zhǎng)爪沙鼠的腦和肺組織，肉眼觀(guān)

7、察其組織病理變化特點(diǎn)；將本實(shí)驗(yàn)部分長(zhǎng)爪沙鼠腦和肺組織制作石蠟切片，用于其病理變化的鏡下觀(guān)察。
　?、芗S便檢查在感染后的第45 d，用生理鹽水直接涂片法在顯微鏡下對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所有存活的長(zhǎng)爪沙鼠糞便進(jìn)行檢查。
　　⑤長(zhǎng)爪沙鼠血清特異性IgG抗體動(dòng)態(tài)變化采集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)爪沙鼠感染后不同時(shí)間的血清，用廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)成蟲(chóng)粗抗原包被96孔ELISA板，采取間接ELISA方法檢測(cè)長(zhǎng)爪沙鼠血清中特異性IgG抗體的水平及分析其動(dòng)態(tài)變化。

8、
　　5、藥物治療效果的觀(guān)察實(shí)驗(yàn)于感染后第8 d對(duì)治療組長(zhǎng)爪沙鼠經(jīng)灌胃給予阿苯達(dá)唑，連續(xù)給藥3 d，未治療組只給予蒸餾水。觀(guān)察并記錄兩組長(zhǎng)爪沙鼠的存活情況，同時(shí)對(duì)死亡的未治療組沙鼠進(jìn)行檢查。在感染后第26 d剖殺所有存活的此兩組長(zhǎng)爪沙鼠，取腦和肺組織，觀(guān)察和比較其病理變化，查找并計(jì)數(shù)蟲(chóng)體，比較兩組之間的差異。
　　研究結(jié)果：
　　1、對(duì)感染敏感性的觀(guān)察
　?、倥c未感染的對(duì)照組比較，長(zhǎng)爪沙鼠在感染后先表現(xiàn)為精神萎靡

9、、食欲減退，后出現(xiàn)脊柱側(cè)彎、步態(tài)不穩(wěn)、打轉(zhuǎn)和癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀。
　?、谌M長(zhǎng)爪沙鼠大約在感染后第22 d開(kāi)始出現(xiàn)死亡。感染組1、感染組2和感染組3，50％感染沙鼠死亡的時(shí)間分別約為感染后第26 d，27 d和第28 d。至感染后第30 d上述三組的死亡率分別約為85%、75%和60%。此外，體重較大者死亡率較低。而對(duì)照組長(zhǎng)爪沙鼠未出現(xiàn)死亡，且攝食和活動(dòng)正常。
　?、坶L(zhǎng)爪沙鼠對(duì)廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)感染極為敏感，且耐受感染的能力較

10、差。因此，本研究選擇以10條幼蟲(chóng)/鼠進(jìn)行感染。
　　2、實(shí)驗(yàn)組感染情況的觀(guān)察
　?、僖话銧顩r：實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)爪沙鼠在感染后第8 d就開(kāi)始有不同程度的萎靡、活動(dòng)減少、食欲減退等癥狀；約第16 d有一部分長(zhǎng)爪沙鼠出現(xiàn)毛發(fā)倒豎、脊柱側(cè)彎、閉眼、不活動(dòng)等癥狀；感染后第17～18 d，部分長(zhǎng)爪沙鼠出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、打轉(zhuǎn)和偏癱等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，并且隨著時(shí)間的推移，出現(xiàn)這些癥狀的長(zhǎng)爪沙鼠的數(shù)量在不斷增加，它們的癥狀也逐漸加重，而且還出現(xiàn)了不同程度的飲

11、水和進(jìn)食困難。而對(duì)照組長(zhǎng)爪沙鼠一般狀況良好，攝食活動(dòng)正常。
　?、谒劳銮闆r：在感染后第22 d就開(kāi)始出現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠死亡，死亡的高峰時(shí)間為感染后的第23～30 d。至感染結(jié)束時(shí)，除了剖殺和死亡外，實(shí)驗(yàn)組最終有12只長(zhǎng)爪沙鼠生存至感染后第46 d；而對(duì)照組長(zhǎng)爪沙鼠未出現(xiàn)死亡。
　?、巯x(chóng)體檢查：實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)爪沙鼠于感染后第7 d在腦和肺組織中均未能檢獲到蟲(chóng)體；感染后第22～46 d之間共檢查長(zhǎng)爪沙鼠35只（包括死亡鼠），從其腦和肺組織中

12、共檢獲蟲(chóng)體127條（♀62/♂65），蟲(chóng)體收獲率約為36.29%（127/350），平均蟲(chóng)數(shù)為3.63±1.46/鼠。感染后第23～30 d檢獲蟲(chóng)體數(shù)最多。對(duì)照組長(zhǎng)爪沙鼠的腦和肺組織均未檢獲到廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)。
　?、芟x(chóng)體組織分布：在實(shí)驗(yàn)組感染長(zhǎng)爪沙鼠中，感染后第22～25 d80%以上的蟲(chóng)體集中在腦，約20%在肺；感染后第30～35 d40%的蟲(chóng)體在腦，而60%的蟲(chóng)體在肺；感染后第41～46 d大約10%的蟲(chóng)體在腦，而90%以上的蟲(chóng)

13、體在肺。
　?、萁M織病理變化：肉眼觀(guān)察顯示，實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)爪沙鼠感染后第7 d腦組織的病理變化不太明顯。感染后第10 d，腦組織表面可出現(xiàn)較明顯的充血。感染后第23 d，長(zhǎng)爪沙鼠以腦部病變?yōu)橹?，腦組織水腫，表面有不同程度的充血、出血、血管擴(kuò)張與粘連；而肺部組織呈彌漫性充血改變。感染后第30～46 d，以肺部病變?yōu)橹?，肺組織有不同程度的局灶性充血腫脹，表面及切面質(zhì)硬粗糙呈灰白色顆粒狀，還可見(jiàn)到點(diǎn)狀、小片狀出血灶；而腦組織只有局限性血管擴(kuò)張

14、和充血。病理切片鏡下觀(guān)察結(jié)果顯示，感染后第27 d，在切片中可見(jiàn)到腦膜增厚、邊緣粗糙，蛛網(wǎng)膜下腔有蟲(chóng)體，蟲(chóng)體周?chē)谐鲅?，而且還有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；感染后第39 d，肺內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)橢圓形廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)卵，蟲(chóng)卵為多細(xì)胞期或幼蟲(chóng)期；病灶處肺泡輪廓大部消失，且有大量滲出和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，呈以蟲(chóng)卵為中心的肉芽腫性炎癥改變。
　?、藜S便檢查和對(duì)應(yīng)的蟲(chóng)體寄生情況：在感染后第45 d，對(duì)實(shí)驗(yàn)組12只長(zhǎng)爪沙鼠進(jìn)行糞便檢查，從4只沙鼠糞便中發(fā)現(xiàn)廣

15、州管圓線(xiàn)蟲(chóng)Ⅰ期幼蟲(chóng)，約占1/3。從上述12只長(zhǎng)爪沙鼠的肺動(dòng)脈中均能檢獲到蟲(chóng)體，有6只長(zhǎng)爪沙鼠為雌雄蟲(chóng)寄生，在這6只長(zhǎng)爪沙鼠中有4只糞便可以查到廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)Ⅰ期幼蟲(chóng)，其中2份糞便在鏡下可見(jiàn)到大量幼蟲(chóng)，而另外2份糞便幼蟲(chóng)較少（均為1條/片）；另外6只長(zhǎng)爪沙鼠為肺部單性蟲(chóng)體寄生，在它們的糞便中均未查到廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)Ⅰ期幼蟲(chóng)。而對(duì)照組的長(zhǎng)爪沙鼠糞便中未查到Ⅰ期幼蟲(chóng)。
　?、哐逄禺愋訧gG抗體的動(dòng)態(tài)變化：長(zhǎng)爪沙鼠血清中特異性IgG抗體水平于

16、感染后第7 d時(shí)就已經(jīng)開(kāi)始輕微升高，在感染后的第30 d達(dá)到高峰，隨后在第37d和45 d水平又呈下降趨勢(shì)。且從感染后第15 d開(kāi)始OD值實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組＞2.1。
　　3、藥物治療效果的觀(guān)察:在感染后第26 d，未治療組長(zhǎng)爪沙鼠均能檢獲到蟲(chóng)體，且都有廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)感染所致的癥狀；而治療組均未能檢獲到蟲(chóng)體，亦無(wú)相應(yīng)的癥狀出現(xiàn)。治療組腦和肺組織病理變化不明顯；而未治療組腦組織表面可見(jiàn)不同程度的充血、出血、血管擴(kuò)張及粘連，肺部也呈彌漫性充

17、血腫脹。
　　結(jié)論：
　　1、不同的感染蟲(chóng)數(shù)，長(zhǎng)爪沙鼠的死亡率不同。感染蟲(chóng)數(shù)越多，其出現(xiàn)癥狀越早，死亡率也越高。廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠以10條幼蟲(chóng)/鼠感染較好，如果感染研究觀(guān)察時(shí)間在25 d以?xún)?nèi)，也可考慮用15條幼蟲(chóng)/鼠或更大蟲(chóng)數(shù)進(jìn)行感染。
　　2、長(zhǎng)爪沙鼠介于廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)的適宜宿主和非適宜宿主之間，且對(duì)廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)感染非常敏感。
　　3、感染后30 d前，長(zhǎng)爪沙鼠以腦部病變?yōu)橹鳎?0 d后，以肺部病變?yōu)橹鳌８?/p>