法尼基焦磷酸合成酶在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌纖維化中的研究.pdf

1、第一部分抑制法尼基焦磷酸合成酶改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化
　　研究背景:
　　心肌成纖維細(xì)胞是心臟中的主要細(xì)胞，在心肌纖維化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。許多體液刺激因子可誘導(dǎo)心肌纖維化，例如血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素1等。多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，如RhoA通路。
　　以往的研究表明雙膦酸鹽，如阿倫磷酸鈉、唑來(lái)磷酸鈉等，可抑制甲羥戊酸途徑中的一種關(guān)鍵酶—法尼基焦磷酸合成酶，從而抑制法尼基化和牻牛

2、兒基牻牛兒基化，進(jìn)而減少異戊二烯的合成，而牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸對(duì)于RhoA的牛兒基牻牛兒基化和活化非常重要。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)主要研究唑來(lái)磷酸鈉是否可通過(guò)抑制法尼基焦磷酸合成酶進(jìn)而抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，同時(shí)研究該作用是否與RhoA通路相關(guān)。
　　方法:
　　(1)、在心肌成纖維細(xì)胞中加入10-30μM唑來(lái)磷酸鈉作用30分鐘，然后加入0.1μM血管緊張素Ⅱ作用48小時(shí)，加藥前細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中

3、孵育24小時(shí)，檢測(cè)心肌纖維化指標(biāo)如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白水平的改變。
　　(2)、在心肌成纖維細(xì)胞中加入10μM唑來(lái)磷酸鈉以及相同濃度的FOH或者GGOH作用30分鐘，然后加入0.1μM血管緊張素Ⅱ作用48小時(shí)，加藥前細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)，檢測(cè)心肌纖維化指標(biāo)如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白和RNA水平的改變。
　　(3)、在心肌成纖維細(xì)胞中加

4、入10μM唑來(lái)磷酸鈉以及相同濃度的GGOH作用48小時(shí)，然后加入1μM血管緊張素Ⅱ作用15分鐘，加藥前細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)，使用pull-down試劑盒和western blot技術(shù)檢測(cè)活性和總RhoA的改變。
　　(4)、在心肌成纖維細(xì)胞中加入50μM siRhoA或control siRNA作用24小時(shí)，然后在無(wú)血清培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)后加入0.1μM血管緊張素Ⅱ作用48小時(shí)，檢測(cè)心肌纖維化指標(biāo)如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原

5、、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白和RNA水平的改變。
　　結(jié)果:
　　(1)、唑來(lái)磷酸鈉作為法尼基焦磷酸合成酶抑制劑可劑量依賴(lài)性抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化指標(biāo)如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白水平的表達(dá)。
　　(2)、GGOH部分逆轉(zhuǎn)了唑來(lái)磷酸鈉的抗心肌纖維化反應(yīng)。
　　(3)、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化反應(yīng)與RhoA活化相關(guān)。
　　(4)、siRhoA抑制

6、了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化指標(biāo)如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白和RNA水平的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明唑來(lái)磷酸鈉通過(guò)抑制法尼基焦磷酸合成酶可有效逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，這種結(jié)果與抑制RhoA的活化和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸化相關(guān)。同時(shí)，抑制RhoA的活性可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化和法尼基焦磷酸合成酶的表達(dá)。
　　第二部分 RNA干擾技術(shù)沉默法尼基焦磷酸

7、合成酶改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化
　　研究背景:
　　第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制法尼基焦磷酸合成酶可以逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化，提示法尼基焦磷酸合成酶可能是血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)心肌纖維化的重要靶點(diǎn)。以往的實(shí)驗(yàn)證明，在體內(nèi)和體外水平的心肌肥厚模型中，法尼基焦磷酸合成酶的表達(dá)明顯升高，同時(shí)，在血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心肌纖維化模型中，RhoA活性表達(dá)明顯上升。上述證據(jù)表明法尼基焦磷酸合成酶可能在血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心肌纖維化模型

8、中的重要性，以及可能與RhoA激活相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)探索法尼基焦磷酸合成酶是否在血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心肌纖維化反應(yīng)中上調(diào)，同時(shí)在此基礎(chǔ)上通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默法尼基焦磷酸合成酶，觀察是否影響心肌纖維化的形成，探索法尼基焦磷酸合成酶下游RhoA活性的變化。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)探索法尼基焦磷酸合成酶是否在血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心肌纖維化反應(yīng)中上調(diào)，同時(shí)在此基礎(chǔ)上通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默法尼基焦磷酸合成酶，觀察是否影響心肌纖維化的形成，探索

9、法尼基焦磷酸合成酶下游RhoA活性的變化。
　　方法:
　　(1)、使用western blot和real-time PCR技術(shù)檢測(cè)血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的體內(nèi)和心肌纖維化模型中法尼基焦磷酸合成酶轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的改變。
　　(2)、選擇法尼基焦磷酸合成酶重組慢病毒轉(zhuǎn)染乳鼠心肌成纖維細(xì)胞，觀察法尼基焦磷酸合成酶下調(diào)是否影響心肌纖維化指標(biāo)如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的改變。
　　(3)、進(jìn)一步在細(xì)胞水平研究法尼基

10、焦磷酸合成酶沉默后下游RhoA的改變，使用pull-down試劑盒和western blot技術(shù)檢測(cè)活性RhoA和總RhoA的改變。
　　結(jié)果:
　　(1)、血管緊張素Ⅱ在誘導(dǎo)心肌纖維化形成的同時(shí)也引起法尼基焦磷酸合成酶的上調(diào)，同時(shí)在8周齡大鼠血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的纖維化心臟中法尼基焦磷酸合成酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平也上調(diào)。
　　(2)、法尼基焦磷酸合成酶重組慢病毒轉(zhuǎn)染乳鼠心肌成纖維細(xì)胞可明顯抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化指標(biāo)