盾殼霉T-DNA插入體庫的構建及兩個分生孢子形成相關基因的克隆.pdf

1、盾殼霉(Coniothyriumminitans)是植物病原真菌核盤菌(Sclerotinia.sclerotiorum)的重要生防真菌。本研究以ZS-1菌株為出發(fā)菌株，建立了農桿菌介導高效轉化盾殼霉的技術體系及克隆相關基因的技術平臺，構建了含30500個轉化子的T-DNA標記插入轉化子庫，克隆到2個與產孢相關的基因，現報道如下： 對農桿菌轉化條件進行了優(yōu)化，建立了高效轉化盾殼霉的技術體系。發(fā)現ZS-1菌株的培養(yǎng)時間、用于轉化的

2、分生孢子濃度、分生孢子與農桿菌共培養(yǎng)的時間等與轉化效率有關。當使用在PDA斜面上培養(yǎng)21d所獲得的分生孢子(濃度為108個孢子/ml)與細菌共培養(yǎng)96h后獲得的轉化效率最高，每皿可以獲得500個轉化子。建立了以熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)、反向PCR(iPCR)、逆轉錄PCR(RT-PCR)、cDNA文庫等為基礎的克隆基因的技術平臺，并利用此技術平臺克隆了產孢相關的基因。 利用上述轉化方法構建了盾殼霉ZS-1菌株的T-

3、DNA插入體庫，獲得了30500個轉化子。自盾殼霉的插入突變體庫中共篩選得到了127株產孢缺陷型突變體，其中65株突變體在PDA平皿上不能產生分生孢子，而另外的62株則可以產生少量的孢子。這些產孢缺陷型突變體在菌絲生長速度、產抗生物質、寄生菌核能力和菌落形態(tài)等方面存在差異顯著性，大多數突變體的T-DNA為單位點插入，且插入位點不同。這即表明盾殼霉的分生孢子形成復雜，受多種基因調控。依據菌落形態(tài)，65株完全不產孢的突變體大致可分為7種類型

4、，即I類：突變體生長緩慢，菌落不能均勻擴展，共26株；II類：突變體生長較緩慢，氣生菌絲茂盛，共28株；Ⅲ類：突變體生長正常，但菌落中央的菌絲塌陷，潰解，僅1株：IV類：突變體生長正常，但與寄主(核盤菌)接觸后可以恢復產孢能力，共3株；V類：菌絲生長塊，甚至超過出發(fā)菌株ZS-1，共5株；VI類：生長緩慢，菌絲稀疏，菌落中有菌絲集結，呈鐵銹色，僅1株；VII類：突變體只能產生分生孢子器而不產生分生孢子，僅1株；另外還有11株菌落形態(tài)上沒有

5、明顯的區(qū)別，沒有具體的歸為哪一類。 對產孢缺陷型突變體ZS-1T2029進行了詳細的研究。突變體ZS-1T2029在菌絲生長和分泌抗生物質等方面與出發(fā)菌株ZS-1相比沒有顯著差異；此突變體仍具寄生核盤菌的能力，在菌核上可以產生分生孢子，但其寄生腐爛菌核的能力顯著下降，顯微觀察發(fā)現ZS-1T2029的分生孢子形成停滯于分生孢子器原基階段。Southern雜交證實T-DNA標記在ZS-1T2029中為單位點插入。證實T-DNA插入破

6、壞了精氨酸特異性氨甲酰磷酸合成酶基因(CMCMPS1)，CMCPS1的cDNA全長為3900bp，編碼含1170個氨基酸的蛋白。Southern雜交分析表明CMCPS1在盾殼霉ZS-1菌株中為單拷貝，Northern雜交顯示在ZS-1T2029中沒有檢測到CMCPS1的mRNA，采用RNAi技術進一步證實CMCPS1與盾殼霉孢子形成相關。在PDA培養(yǎng)基中添加精氨酸或瓜氨酸可以恢復ZS-1T2029產孢試驗表明T-DNA插入破壞CMCPS

7、1導致不能合成精氨酸是ZS-1T2029不能產孢的原因。因此，精氨酸與盾殼霉分生孢子形成相關。在PDA培養(yǎng)基中添加一氧化氮供體硝普鈉(SNP)可恢復ZS-1T2029產孢，而在PDA中添加一氧化氮合成酶(NOS)抑制劑L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)可以抑制ZS-1菌株產生分生孢子，試驗結果表明精氨酸通過一氧化氮調控盾殼霉的分生孢子形成。進一步研究發(fā)現：一氧化氮在分生孢子器原基及分生孢子器中有大量的積累，而在菌絲中累積不明顯；在PDB

8、培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，在ZS-1和ZS1-T2029中均可以產生NO，其釋放量在第3d達到最高，但后者NO的產量顯著下降。 對產孢缺陷型突變體ZS-1T21882進行研究。ZS-1T21882在菌絲生長、寄生能力和分泌抗生物質等方面與出發(fā)菌株ZS-1相比沒有顯著差異。突變體與核盤菌菌落接觸的地方及其菌核上均能夠產生分生孢子，但在液體振蕩培養(yǎng)時僅能形成分生孢子器原基。Southern雜交證實T-DNA標記在ZS-1T21882中為單拷

9、貝插入。對ZS-1T21882中T-DNA插入破壞的基因進行了全長cDNA克隆，證實T-DNA插入破壞了谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸轉酰胺酶基因(CMAMPRS1)；CMAMPRS1的全長cDNA為1749bp，含一個1560bp的完整閱讀框架(ORF)，該ORF編碼含583個氨基酸的蛋白質。CMAYPRS1在盾殼霉基因組中為單拷貝，RT-PCR結果顯示此基因在突變體ZS-1T21882中不表達，而在出發(fā)菌株ZS-1中有表達。谷氨酰胺磷酸核糖