免疫調節(jié)劑CH對活動期類風濕關節(jié)炎患者iNKT細胞影響的實驗研究.pdf

1、目的：研究免疫調節(jié)劑CH1b、CH2b對健康人和活動期RA患者iNKT細胞體外增殖與功能的影響,對比CH1b、CH2b對兩組iNKT細胞作用的差異；并探討iNKT細胞對CH1b、CH2b可能的識別方式和細胞活化信號通路，為今后的臨床應用提供理論依據。
　　方法：①觀察免疫調節(jié)劑CH1b、CH2b體外對健康人和活動期RA患者iNKT細胞體外增殖與功能的影響。首先，收集健康人和活動期RA患者外周靜脈抗凝血并分離單個核細胞(periph

2、eral blood mononuclear,PBMC)；其次，經α-半乳糖神經鞘胺醇（α-Galcer）和IL-2體外刺激擴增后，利用磁珠分選(MACS)技術分離擴增后PBMC得到純化的恒定型自然殺傷細胞(iNKT細胞)；再次，分別與免疫調節(jié)劑CH1b、CH2b共孵育后，采用MTT法定量檢測各組iNKT細胞增殖率；MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit檢測相應細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ/IL

3、-4的水平；RT-PCR檢測各組iNKT細胞中IFN-γmRNA與IL-4 mRNA表達水平；MTT法檢測各組iNKT細胞對K562細胞的殺傷活性。
　?、谔接慽NKT細胞對CH1b、CH2b可能的識別方式和細胞活化信號通路。首先，收集健康人外周靜脈抗凝血并分離PBMC，經α-Galcer和IL-2體外刺激擴增后，利用MACS技術分離得到純化的iNKT細胞；其次，分別與免疫調節(jié)劑CH1b、CH2b及相應CH的抗CD1d共孵育后，采

4、用MTT法定量檢測各組iNKT細胞增殖率；MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit檢測相應細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ/IL-4的水平；RT-PCR檢測各組iNKT細胞中IFN-γmRNA與IL-4 mRNA表達水平；MTT法檢測各組iNKT細胞對K562細胞的殺傷活性；再次，Western-Blot檢測CH1組、CH2b組iNKT細胞中T-bet與GATA3表達水平，明確CH刺激iNKT細胞活化

5、的分子機制。
　　結果：1.兩組樣品中單獨IL-2組、CH1b組、CH2b組及空白對照組增殖均不明顯（P>0.05）。與相應的對照組相比，IL-2+α-Galcer組增值率均明顯升高(P<0.05)。與相應IL-2+α-Galcer組相比，健康人與活動期RA患者IL-2+CH1b組、IL-2+CH2b組iNKT細胞增值率顯著提高(P<0.05)。但RA患者各組增殖率均顯著低于健康人的相應對照部分(P<0.05)；與相應對照組相比，

6、α-Galcer均能顯著促進iNKT細胞IFN-γ的分泌，CH1b、CH2b能明顯增加IL-4的分泌(P<0.05)，降低IFN-γ/IL-4(P<0.05)，而對IFN-γ分泌的影響未見顯著性差異(P>0.05)。RA病人各組細胞因子含量雖低于相應健康人部分，但均明顯高于對照組(P<0.05)；與相應的對照組相比，健康人與活動期RA患者iNKT細胞α-Galcer組IFN-γmRNA表達均明顯增高(P<0.05)；CH1b組和CH2b

7、組IL-4 mRNA的表達均明顯增高(P<0.05)而IFN-γmRNA表達無顯著性差異(P>0.05)；CH1b、CH2b能顯著促進健康人與活動期RA患者iNKT細胞對K562細胞的殺傷活性(P<0.05)，但RA患者各組殺傷率均顯著低于健康人的相應對照部分(P<0.05)。
　　2.抗CD1d組iNKT細胞增殖率、IL-4分泌、IL-4 mRNA表達、殺傷活性均低于相應CH組，與對照組相比差異不明顯。提示CD1d抗體抵消了CH

8、1b、CH2b對IL-2刺激iNKT細胞增殖的促進作用、對IL-4分泌的促進作用、對IFN-γ/IL-4的下調作用、對IL-4 mRNA表達的上調作用和對iNKT細胞殺傷活性的促進作用；與對照組相比，CH1b組和CH2b組T-bet表達差異不明顯而GATA3的表達明顯增高。
　　結論：1.CH1b、CH2b能促進健康人與活動期RA患者經IL-2活化的iNKT細胞體外增殖,活動期RA患者iNKT細胞存在增殖或活性低下；CH1b、CH

9、2b能刺激健康人與RA患者iNKT細胞分泌具有明顯Th2傾向的細胞因子，可能具有調節(jié)免疫紊亂和過度炎癥反應的功效（CH2b更突出）；CH1b、 CH2b主要通過上調IL-4 mRNA的表達，影響iNKT細胞分泌的細胞因子，對調節(jié)活動期RA患者Th1/Th2失衡，抑制過度炎癥反應具有重要意義（CH2b更為突出）；此外，CHlb、CH2b能夠顯著增強iNKT細胞毒活性；活動期RA患者iNKT細胞存在功能缺陷。
　　2.iNKT細胞對C