EZH2在肝纖維化中的作用及其部分機制研究.pdf

1、肝纖維化是所有慢性肝臟疾病形成的共同病理反應過程，活化的肝星狀細胞分泌的細胞外基質（ECM）的增多是肝臟纖維化發(fā)病的最主要特征之一，肝星狀細胞（HSC）的增殖和活化是肝臟纖維化形成的關鍵環(huán)節(jié)，抑制HSC的增殖和活化成為抗肝纖維化治療的重要手段之一。研究表明組蛋白甲基化在HSC的增殖活化過程中起到了很重要的作用，但具體機制尚不明確。為了更進一步地探討組蛋白甲基化在肝纖維化形成過程中的重要作用及其機制，通過在體與離體兩個不同的角度，首先觀察

2、在肝纖維化組織中和活化的肝星狀細胞中與組蛋白甲基化有關的轉移酶的表達變化情況，再觀察組蛋白甲基化有關的轉移酶對HSC增殖和活化的影響，最后更深一步地探討了其部分作用機制。本文主要研究內容包括下面四個部分：
　　1. CCl4誘導的大鼠肝臟組織中EZH2和Dkk1的表達變化。
　　將40只大鼠分為正常組10只和模型組30只，取CCl4進行腹腔注射用以建立大鼠肝纖維化的模型。模型組的大鼠以50％CCl4植物油溶液(1ml/kg)

3、進行腹腔注射，每周注射2次，共注射12周；正常組以相同劑量植物油進行腹腔注射，同樣每周注射2次，共注射12周。在12周結束后，處死實驗大鼠并獲取肝臟組織進行H&E染色和Masson染色的檢測，并應用Real-time PCR、Western Blot法和免疫組化法檢測分析α-SMA、EZH2和Dkk1在大鼠肝組織中的表達變化。實驗的結果發(fā)現(xiàn)，EZH2在肝臟纖維化形成過程中表達升高，Dkk1在肝臟纖維化形成過程中表達降低。
　　2.

4、 TGF-β1誘導的HSC-T6細胞中EZH2和Dkk1的表達變化。
　　實驗研究的對象選取HSC-T6細胞，應用10ng/ml TGF-?1分別刺激細胞24h和48h后，收取細胞，提取RNA和蛋白，應用Real-time PCR和Western Blot法檢測分析在TGF-β1刺激的HSC-T6細胞中α-SMA、EZH2和Dkk1表達變化情況。實驗結果發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1誘導活化的HSC-T6細胞中EZH2表達升高，Dkk1表達

5、降低。
　　3.抑制EZH2的表達可以阻抑TGF-β1誘導的HSC-T6細胞的增殖和活化。
　　1）實驗研究的對象選取HSC-T6細胞，應用MTT的方法檢測EZH2的抑制劑DZNep對TGF-β1誘導的HSC-T6細胞增殖活性的影響。實驗分為對照組、模型組、DZNep作用6h組、DZNep作用12h組、DZNep作用24h組和DZNep作用48h組。實驗結果發(fā)現(xiàn)，DZNep可以抑制由TGF-β1誘導的HSC-T6細胞的增殖，

6、抑制程度和DZNep濃度有關。實驗研究的對象選取HSC-T6細胞，實驗可分組為對照組、模型組、陰性對照組和EZH2-siRNA實驗組。同樣應用MTT法檢測 si-EZH2對 TGF-β1誘導的 HSC-T6細胞增殖活性的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn)，si-EZH2可以抑制由TGF-β1誘導的HSC-T6細胞的增殖。以上結果說明，DZNep和si-EZH2導致的EZH2的表達沉默都可以抑制由TGF-β1誘導的HSC-T6細胞的增殖。
　　2）

7、實驗研究的對象選取HSC-T6細胞，應用10ng/ml TGF-?1刺激HSC-T6細胞30min后，加入1ng/ml的DZNep溫育24h，采用Real-time PCR方法檢測分析α-SMA和EZH2的mRNA表達變化；采用Western Blot法檢測分析α-SMA和EZH2的蛋白表達變化情況。實驗結果發(fā)現(xiàn)，DZNep可以抑制由TGF-β1誘導的HSC-T6細胞的活化。同樣實驗研究的對象選取HSC-T6細胞，依據EZH2基因序列設

8、計與合成EZH2的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)即si-EZH2，應用脂質體LipofectamineTM2000轉染到HSC-T6細胞中。采用Real-time PCR方法檢測分析α-SMA和EZH2的 mRNA表達變化；采用Western Blot法檢測分析α-SMA和EZH2的蛋白表達變化情況。實驗結果發(fā)現(xiàn)，si-EZH2可以抑制由TGF-β1誘導的HSC-T6細胞的活化。以上結果說明，DZ

9、Nep和si-EZH2導致的EZH2的表達沉默都可以抑制由TGF-β1誘導的HSC-T6細胞的活化。
　　4.抑制EZH2表達后HSCs增殖活化被影響的部分機制研究。
　　1）實驗研究的對象選取 HSC-T6細胞，依據 Dkk1的基因序列設計與合成Dkk1的小干擾RNA，應用脂質體LipofectamineTM2000轉染到HSC-T6細胞內。采用Real-time PCR方法檢測分析Dkk1和α-SMA的mRNA表達變化情

10、況；采用Western Blot法檢測分析Dkk1、β-catenin、C-myc、CyclinD1和α-SMA的蛋白表達變化情況。實驗結果發(fā)現(xiàn)，沉默Dkk1促進了由TGF-β1誘導的HSC-T6細胞的增殖和活化。同樣實驗研究的對象選取 HSC-T6細胞，如前面所述應用DZNep和si-EZH2抑制EZH2的表達，采用Real-time PCR方法檢測分析Dkk1的mRNA表達變化情況；采用Western Blot法檢測分析Dkk1和H

11、3K27me3的蛋白表達變化情況。實驗結果發(fā)現(xiàn)，Dkk1的表達變化受到EZH2的調控。同樣實驗研究的對象選取HSC-T6細胞，如前面所述應用DZNep和si-EZH2抑制EZH2的表達，采用Western Blot法檢測分析β-catenin、C-myc和CyclinD1的蛋白表達變化情況。實驗結果發(fā)現(xiàn)，EZH2介導的Dkk1的表達下降導致了Wnt/β-catenin通路的激活。同樣實驗研究的對象選取HSC-T6細胞，如前面所述采用DZ

12、Nep抑制EZH2的表達，采用si-Dkk1抑制Dkk1的表達，同時采用DZNep抑制EZH2的表達和采用si-Dkk1抑制Dkk1的表達。Real-time PCR方法檢測分析Dkk1和α-SMA的mRNA表達變化情況；Western Blot法檢測分析Dkk1、β-catenin、C-myc、CyclinD1和α-SMA的蛋白表達變化。實驗結果發(fā)現(xiàn)，Dkk1在EZH2介導的Wnt/β-catenin通路的激活中起到了重要的作用。以上