骨髓間充質干細胞移植對大鼠腦梗死后神經功能恢復及Nogo受體表達的影響.pdf

1、研究背景：腦梗死又稱缺血性腦卒中，是腦血管病的最常見類型，約占全部腦血管病的70％。中風后，腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)神經功能缺損。腦梗死后神經的再生問題，日益受到關注。目前研究表明，早期神經元再生失敗的主要原因是存在Nogo、髓鞘相關糖蛋白(MAG)、少突膠質細胞髓鞘糖蛋白(Omgp)等髓磷脂抑制物的過表達。這類抑制物與共同的受體——Nogo受體(Nogo Recepotr,NgR)結合，通過Rho-ROCK途徑產生神經再生抑制作用

2、，所以近年來Nogo或NgR成為了神經修復研究的新靶點。體內實驗表明，抑制Nogo或NgR后，健側腦皮質發(fā)射到腦干及對側脊髓的神經纖維突起可出現(xiàn)代償性增生，從而在解剖學上起代償性修復。體外實驗發(fā)現(xiàn)，背根神經節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)在含有神經蛋白聚糖(CSPG)、MAG及Nogo-A的培養(yǎng)液中可出現(xiàn)軸突生長受到抑制，也揭示了Nogo在神經再生中的作用。更有趣的是，DRG與MSCs條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后，可減輕上述抑

3、制物對DRG神經突起生長的抑制。這提示我們，MSC移植可能通過以下途徑促進神經突起的再生：分泌營養(yǎng)因子刺激神經生長；也可能通過抑制細胞外的神經抑制因子起作用。目前MSCs移植修復腦梗死已證明可能有以下機制：細胞替代作用；促進內生源神經干細胞的增殖及遷移；分泌多種神經營養(yǎng)因子，促進新生血管生成，保護梗死后半暗區(qū)的神經元免于死亡，促使軸突生長。其中，MSCs促進神經再生的現(xiàn)象是否通過降低NgR表達起作用的，目前SCI未見報道。所以我們通過動

4、物實驗研究MSCs對NgR表達的影響，初步探討MSCs是否可能通過Nogo/NgR通路來達到修復作用。
　　 目的：探討MSCs移植治療腦梗死大鼠是否可影響NgR的表達，MSCs是否可能通過Nogo/NgR通路來達到修復作用。
　　 材料與方法：
　　 1.采用貼壁分離法提取及培養(yǎng)MSCs，用流式細胞儀法鑒別MSCs，再通過多向分化誘導證實。
　　 2.通過大腦中動脈電凝術(MCAO)建立大鼠腦梗死模型，

5、造模成功后將大鼠分為非移植組、3×106MSCs移植組、6×106MSCs移植組，同時設立假手術組作為對照組。3×106MSCs移植組和6×106MSCs移植組在造模成功24h后，分別通過靜脈注射移植3×106及6×106個第3代MSCs，移植前用Hoechst標記MSCs。
　　 3.采用神經損傷嚴重程度評分(NSS)評價各組神經功能恢復狀況。
　　 4.分別于第1、2、3周取材，石蠟包埋后切片，片厚3μm，Nissl

6、染色觀察病灶周圍神經元的存活情況，用免疫組織化學檢測病灶周圍ki67、GFAP的表達及患側室管膜下區(qū)ki67的表達，免疫組織化學及Western Blotting檢測假手術組、非移植組及MSCs移植組NgR表達的改變。
　　 結果：
　　 1.用貼壁分離法可提取到純度高、活性好的MSCs，同時可在體外誘導分化為神經元樣細胞及成骨樣細胞。
　　 2.MCAO術后1d，右側前肢感覺運動皮質及軀體感覺皮質出現(xiàn)損害，大鼠

7、出現(xiàn)左側前肢不能完全伸直、右側感覺障礙等表現(xiàn)。MCAO術后1w、2、3w，非移植組及MSCs移植組神經功能均可出現(xiàn)恢復，其中3×106MSCs移植組和6×106MSCs移植組兩組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但較非移植組有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。
　　 3.與假手術組比較，MCAO術后，患側及對側大腦組織的NgR可出現(xiàn)過表達，以第1周時為明顯。
　　 4.MSCs移植后1、2、3w，MSCs移植組病灶周圍的神經元及

8、ki67較MCAO非移植組增多，同時患側室管膜下區(qū)的ki67也較非移植組增多，且6×106MSCs移植組較3×106MSCs移植組明顯。
　　 5.MSCs移植后，大腦皮質NgR表達下降，以患側運動區(qū)皮質、島葉皮質及對側第一運動皮質等為主，且6×106MSCs移植組較3×106移植組下降幅度更大。
　　 7.Western Blotting顯示，MCAO術后1、2、3w，3×106MSCs移植組病側周圍的NgR表達較非移

9、植組下降(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.大鼠MCA皮質支閉塞后，患側的前肢感覺運動皮質及軀體感覺皮質出現(xiàn)壞死，大鼠神經功能受損。
　　 2.MSCs可促進MCAO模型大鼠的神經功能恢復。
　　 3.MCAO術后，大鼠出現(xiàn)雙側大腦皮質NgR表達增高，以第1周時為明顯，第2周后出現(xiàn)下降，但仍高于假手術組。
　　 4.MSCs移植可降低病灶周圍腦皮質功能區(qū)及對側第一運動皮質區(qū)的NgR表達，同