乳腺癌骨髓微轉移檢測及特異性免疫治療的實驗研究.pdf

1、目的：乳腺癌已成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，并呈逐年升高趨勢，雖然采取以手術為主的綜合治療措施，但其遠期生存率并沒有獲得明顯提高，影響預后的主要因素是發(fā)生了遠處器官的轉移。據(jù)臨床資料統(tǒng)計顯示，約有25～30％腋淋巴結陰性的乳腺癌患者，于術后5年內(nèi)出現(xiàn)遠處轉移而導致治療失敗，如果能在早期檢測到微小轉移灶，則對疾病的分期、治療及改善預后具有重要意義。骨髓是乳腺癌最易發(fā)生轉移的部位，骨髓微轉移(bone marrow micrometasta

2、sis，BMM)的檢測較腋窩淋巴結和外周血更能反映腫瘤細胞的全身播散情況，不僅能動態(tài)監(jiān)測轉移、觀察療效，并可成為預測乳腺癌預后的獨立因素。因此，對于遠處微小轉移灶的早期檢測及治療成為提高乳腺癌患者遠期生存率的主要途徑之一。 造成乳腺癌患者治療后復發(fā)和轉移的主要原因是機體免疫力低下及腫瘤的免疫逃逸機制。因此，免疫治療正逐漸成為腫瘤綜合治療的研究熱點，有望成為腫瘤治療的又一主要手段。免疫治療中常用的活性細胞有：淋巴因子激活的殺傷細胞

3、(LAK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)和特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)。有報道提出，利用樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的高抗原遞呈活性，將乳腺癌細胞抗原肽負載DC，從而激活機體免疫反應，可促進抗瘤效應和特異性。樹突狀細胞作為唯一的專職抗原遞呈細胞(antigen processing cell，APC)，處于免疫反應的中心地位。非成熟的DC捕獲抗原后被激活成為成熟的DC，其細胞表面表

4、達MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子、共刺激分子B<,7>-1(CD80)和B<,7>-2(CD86)、黏附分子CD54(ICAM-1)和CD50(ICAM-3)等，并將抗原肽遞呈給CD4<'+>和CD8<'+>T細胞，誘導其成為特異性細胞毒性T細胞(CTL)，分泌細胞因子(如IL-12等、)，產(chǎn)生Th1型免疫應答而發(fā)揮抗腫瘤作用。 我們采用免疫磁珠(IMB)富集聯(lián)合掃描電鏡(SEM)及激光共聚焦顯微鏡(LSM)，檢測了乳腺癌患者骨髓微轉移

5、(BMM)；從乳腺癌患者腋窩區(qū)域引流淋巴結單個核細胞中，誘導培養(yǎng)DC和腫瘤抗原特異性CTL，通過體外和乳腺癌荷瘤裸鼠體內(nèi)殺傷實驗，以期尋找一種治療乳腺癌微轉移的新途徑。 方法： 第一部分IMB聯(lián)合SEM、LSM檢測乳腺癌骨髓微轉移 選取2006年3月至10月我院收治的乳腺癌患者45例，健康志愿者04例(均簽署了骨髓穿刺知情同意書)。研究對象均為女性，年齡30～67歲，平均49.8歲。術前在局部浸潤麻醉下，行髂前上

6、棘骨髓穿刺，抽取骨髓10～15ml，應用淋巴細胞分離液分離、收集有核細胞，IMB富集陽性對照、正常人對照、乳腺癌患者骨髓中轉移的腫瘤細胞，將富集后細胞分成兩等份，一份在SEM下采集腫瘤細胞圖像，另一份用anti-CK-FITC標記細胞，在LSM下檢測CK<'+>細胞。將乳腺癌細胞株MDA-231制作成電鏡標本，SEM下采集標準乳腺癌細胞的超微結構圖象。 第二部分乳腺癌腋下淋巴結來源的DCs對自體CTLs體外特異性殺傷活性的影響

7、 術中嚴格無菌摘取乳腺癌引流淋巴結1～2枚，用機械法獲取淋巴細胞懸液，并用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，以含有10％胎牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基重懸、培養(yǎng)2h，貼壁細胞以rhGM-CSF(1000U/ml)，rhIL-4(200U/ml)和TNF-α(200U/ml)聯(lián)合培養(yǎng)誘導DCs；非貼壁細胞，加入rhIL-2(200U/ml、)培養(yǎng)為TDLNCs。用酶消化法將乳腺癌組織制備自體乳腺癌單細胞懸液，通過凍融法制備腫瘤抗原，負

8、載DCs，將后者與TDLNCs共培養(yǎng)，以誘導腫瘤特異性CTLs。分別培養(yǎng)至第1天和第7天收獲DCs，加入PE-CD1a、PE-CD83、FITC-CD86單克隆抗體，用流式細胞分析儀檢測細胞表型；于第7天和第10天收獲DC-TDLNCs，分別加入FITC-CD3單克隆抗體，F(xiàn)ITC-CD4/PE-CD8二聯(lián)抗體，檢測其細胞表型。用非放射性細胞毒分析試劑盒，測定不同方法誘導的CTLs細胞對自體乳腺癌細胞和MCF-7細胞的體外殺傷活性，分析

9、經(jīng)誘導的DCs功能和CTLs殺傷特異性。 第三部分自體腫瘤特異性CTLs對裸鼠乳腺癌模型抑瘤作用的研究 手術時分別無菌切取2例乳腺癌患者癌組織，剪成約1mmm<'3>大小組織塊。將32只3～4周齡BALB/c裸鼠隨機分成4組，每組8只，癌組織分別種植于裸鼠胸墊部皮下，建立裸鼠乳腺癌模型，移植瘤生長2周后，每5天注射一次不同的免疫效應細胞。(1)腫瘤特異性CTL組：每只裸鼠局部注射腫瘤特異性CTLs 0.2ml(5×10<

10、'6>/ml)；(2)非特異性CTL組：每只裸鼠局部注射未經(jīng)自體腫瘤凍融抗原激活的非特異性CTLs 0.2ml(5×10<'6>/ml)：(3)異體CTL組(種植另一患者癌組織)：每只裸鼠局部注射非自體腫瘤特異性CTLs 0.2ml(5×10<'6>/ml)；(4)空白對照組：每只裸鼠移植瘤模型局部注射生理鹽水0.2ml。每5天用游標卡尺測量腫瘤長徑(a)、短徑(b)，按體積(V)=πab<'2>/6計算腫瘤體積，并計算腫瘤生長抑制率，

11、30天后處死裸鼠取出瘤塊。將腫瘤組織放入福爾馬林溶液中固定、脫水、石蠟包埋、切片。經(jīng)常規(guī)HE染色，鏡下觀察腫瘤細胞形態(tài)；免疫組化染色，觀察T細胞和樹突狀細胞浸潤情況。 結論： 1 IMB聯(lián)合SEM、LSM檢測原發(fā)性乳腺癌BMM，陽性檢出率為35.6％。 2 乳腺癌BMM與原發(fā)腫瘤大小及臨床病理TNM分期有關，腫瘤的侵襲轉移能力隨著原發(fā)腫瘤增大而增強，臨床分期越晚，出現(xiàn)骨髓轉移幾率越高。但腫塊小、無淋巴結轉移的Ⅰ期

12、乳腺癌患者，亦存在約20％的BMM，提示乳腺癌是一種全身性疾病，轉移及播散很早即可發(fā)生。 3 雖然乳腺癌BMM與腋淋巴結轉移與否無明顯相關性，但進一步分層研究發(fā)現(xiàn)，隨著腋淋巴結轉移數(shù)目的增加BMM陽性率增高，說明血行播散與淋巴結轉移是乳腺癌轉移的兩條相對獨立的途徑，當腋窩淋巴結出現(xiàn)較多轉移時，癌細胞可能通過淋巴導管再次入血從而增加了轉移機會。 4 乳腺癌BMM陽性率隨組織學分級增加而升高，說明分化程度低的腫瘤細胞具有更強

13、的增殖、侵襲、轉移能力，對這部分病人應加強化療等綜合性治療，密切關注全身轉移情況。 5 乳腺癌BMM陽性率隨ER、PR蛋白表達增強而降低，說明分化愈差的腫瘤細胞，ER、PR丟失愈多，可能具有更強的增殖、侵襲、轉移能力。 6 本研究未發(fā)現(xiàn)乳腺癌BMM與患者的年齡、月經(jīng)狀況、病理類型及腫瘤組織中C-erbB-2、VEGF的表達有關。 7 乳腺癌患者腋下引流淋巴結來源的單個核細胞，在rhGM-CSF、rhIL.4刺激活

14、化和自體乳腺癌細胞凍融抗原及TNF-α作用下，可以誘導培養(yǎng)出具有典型細胞學形態(tài)特征和高表達DC特異性表面標志物的成熟DCs，并具有較強的抗原提呈功能，可以促進TDLNCs增殖、分化為腫瘤抗原特異性CTLs。 8 腫瘤抗原特異性CTLs對自體乳腺癌細胞有較高的體外殺傷效應，而對異體乳腺癌細胞不具有特異性殺傷效應。未經(jīng)自體乳腺癌細胞凍融抗原刺激誘導的DCs雖也可以使TDLNCs增殖、分化為CTs,但此CTLs不具有針對自體乳腺癌細胞