UTMD聯(lián)合納米粒及HTERT-CMV啟動子靶向沉默HSP70治療前列腺癌的研究.pdf

1、雄激素非依賴性前列腺癌(HRPC)的治療是目前公認的難題，腫瘤的基因治療是醫(yī)學界研究的熱點，選擇合適的靶基因及安全有效的基因轉染途徑是基因治療成功的關鍵。
　　HSP70在多種惡性腫瘤細胞中優(yōu)先大量地表達，與腫瘤細胞抗凋亡及熱療甚至放化療耐受性等許多惡性行為密切相關，HSP70在前列腺癌細胞中尤其是雄激素非依賴性的癌細胞中呈現(xiàn)顯著高表達，若阻斷癌細胞內HSP70的合成，腫瘤細胞不能維持其正常代謝，發(fā)生生長抑制或凋亡。85％以上的原

2、發(fā)性腫瘤中端粒酶呈陽性，端粒酶逆轉錄酶(HTERT)啟動子調控的下游基因可選擇性地在端粒酶陽性的惡性腫瘤細胞中表達，具有明顯的腫瘤靶向性。本研究以HSP70為靶點設計構建含有腫瘤特異性啟動子HTERT核心序列及短發(fā)夾狀RNA(ShRNA)的psilencer4.1質粒表達載體，并以前列腺癌細胞22RV1為靶細胞，在基因水平上沉默下調HSP70的表達，削弱HSP70為腫瘤細胞提供的生存優(yōu)勢，促進癌細胞凋亡。
　　本實驗采用多聚物納米

3、粒Xfect Polymer（購自Clontech生物公司）將目的質粒包裹，在超聲靶向微泡破壞(UTMD)激發(fā)的聲孔效應(sonoporation)下，攜載目的質粒的納米粒成功轉入癌細胞，這種納米粒既能有效保護質粒DNA在體內轉運過程中免受核酸酶降解，又增加了細胞膜的流動性，為細胞膜臨時性微孔的開放與修復封閉提供了便利條件。
　　本研究主要分為三個部分:
　　第一章：腫瘤特異性質粒構建及功能驗證
　　目的:設計構建含有

4、目的片段的質粒psilencer4.1-EGFP-HTERT/CMV-HSP70-ShRNA，同時構建psilencer4.1-CMV-HSP70-ShRNA-EGFP，psilencer4.1-HTERT/CMV-EGFP為對照質粒，并驗證目的質粒的功能，為后期轉染實驗準備材料。
　　方法:分別選用雄激素非依賴性前列腺癌細胞22RV(1)及正常前列腺上皮細胞RWPE-1驗證構建的質粒載體，采用脂質體lipo2000對2種細胞分別

5、進行了3種質粒的轉染實驗，熒光顯微鏡觀察EGFP表達初步評估轉染情況，流式細胞儀檢測轉染率，realtime-PCR技術檢測HSP70-ShRNA的干擾效果。
　　結果:端粒酶高活性的前列腺癌細胞22RV(1)的目的質粒平均轉染率(14.92±0.70％)明顯高于正常前列腺上皮細胞RWPE-1(4.6±0.71％)，而由CMV啟動子驅動的對照質粒在RWPE-1的轉染率(12.2±0.73％)高于22RV(1)(8.92％±1.12

6、％);realtime-PCR技術顯示實驗組HSP70-mRNA的表達量約為PBS組的51.2±1.71％，顯示出HSP70-ShRNA的干擾功能。
　　結論:本實驗構建的目的質粒載體顯示出HTERT啟動子的腫瘤特異性及HSP70-ShRNA的干擾功能，該質?？梢杂糜诤笃谵D染實驗。
　　第二章：UTMD聯(lián)合多聚物納米粒促進目的質粒體外轉染前列腺癌細胞的研究
　　目的:借助UTMD聯(lián)合多聚物納米粒XfectPolymer

7、進行體外基因轉染實驗，通過檢測轉染率及HSP70-ShRNA的干擾效果評估UTMD等多種技術聯(lián)合促進細胞內基因轉染的可行性。
　　方法:體外實驗按照1×105/孔接種前列腺癌細胞22RV1于24孔板，篩選優(yōu)化條件后分組處理，以PBS組，plasmid組，UTMD+plasmid組，XfectPolymer+plasmid組為對照組，以UTMD+XfectPolymer+plasmid組為實驗組進行基因轉染實驗，轉染后48小時，通過

8、流式細胞儀檢測轉染率及細胞凋亡率，并通過western-blot及reatime-PCR技術檢測HSP70-ShRNA的干擾效果;采用transwell及細胞劃痕實驗檢測腫瘤細胞侵襲及遷移能力的變化，并通過CCK-8細胞毒性實驗及細胞平板克隆實驗檢測該技術對細胞近遠期活性的影響。
　　結果:本實驗采用UTMD聯(lián)合低劑量的XfectPolymer共同促進目的質粒轉染，實驗組轉染率及凋亡率最高，約為XfectPolymer+piasm

9、id組的2倍，分子生物學相關技術檢測結果顯示腫瘤細胞HSP70基因表達下降，其侵襲及遷移能力明顯減弱，而CCK8細胞毒性實驗及細胞平板克隆實驗中，實驗組與對照組沒有明顯差異，顯示了該技術的安全性。
　　結論:UTMD聯(lián)合XfectPolymer及HTERT特異性啟動子共同沉默HSP70表達，明顯誘導了體外前列腺癌細胞凋亡，抑制了腫瘤細胞的生長及遷移侵襲，該實驗可望為惡性腫瘤基因治療提供實驗基礎。
　　第三章：UTMD聯(lián)合多聚

10、物納米粒促進目的質粒轉染前列腺癌移植瘤的實驗研究
　　目的:UTMD聯(lián)合多聚物納米粒XfectPolymer介導目的質粒轉染移植瘤，通過檢測靶基因分子水平改變、腫瘤超微結構及血供情況的變化等評估體內基因轉染效果，評價該基因傳遞方法促進體內基因轉染的可行性。
　　方法:將22RV1細胞皮下接種35只雌性BALB/c裸鼠建模，腫瘤體積約為50-60mm3時分組研究，分組與體外實驗一致，電鏡觀察轉染后腫瘤細胞超微結構的變化，并對腫

11、瘤組織進行了HSP70及caspase3免疫組化研究，實驗處理前及實驗處理后2周對腫瘤血液灌注的改變進行超聲造影分析評估。
　　結果:轉染實驗后72h，電鏡結果顯示與對照組相比，實驗組腫瘤組織內有更多的細胞出現(xiàn)了細胞膜固縮，核染色質凝聚及邊移等凋亡現(xiàn)象，而caspase3的高表達顯示有效沉默HSP70的表達可以促進腫瘤細胞的凋亡;轉染實驗后2周實體腫瘤造影分析顯示實驗組腫瘤微循環(huán)灌注不佳，其生長受到了有效抑制。
　　結論:重