乙型肝炎病毒對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究目的：
　　 通過(guò)將PHY106-CHBV質(zhì)粒（含C基因型HBV的全基因組）轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的正常人腎小球系膜細(xì)胞(NHMC)，研究乙型肝炎病毒(HBV)在NHMC細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及淋巴細(xì)胞對(duì)表達(dá)乙肝標(biāo)志物的NHMC細(xì)胞凋亡的影響。初步探討乙型肝炎病毒在乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎(HBV-GN)腎損傷中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將C基因型重組全長(zhǎng)乙型肝炎病毒(PHY106-CH

2、BV)轉(zhuǎn)染至人腎小球系膜細(xì)胞(NHMC)。收集24、48和72h細(xì)胞培養(yǎng)上清液，進(jìn)行HBsAg與HBeAg的定量檢測(cè)；應(yīng)用倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。MTT法檢測(cè)NHMC細(xì)胞增殖率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)NHMC細(xì)胞凋亡率。半定量RT-PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2mRNA在NHMC細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。Caspase-3酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NHMC細(xì)胞內(nèi)Caspase-3酶的活性。將人外周血淋巴細(xì)胞與各組NHMC細(xì)胞共培養(yǎng)，收集48h

3、培養(yǎng)上清液進(jìn)行HBsAg與HBeAg的定性檢測(cè)。MTT法檢測(cè)與人外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的NHMC細(xì)胞的增殖率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)NHMC細(xì)胞的凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 轉(zhuǎn)染PHY106-CHBV的NHMC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可檢測(cè)到HBsAg和HBeAg的高表達(dá)。轉(zhuǎn)染PHY106-CHBV48h后可誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、聚集，細(xì)胞稀疏，呈放射狀，細(xì)胞核出現(xiàn)大小不等的凋亡小體。MTT結(jié)果顯示實(shí)

4、驗(yàn)組細(xì)胞增殖受抑；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率(5.84±1.70)％與正常對(duì)照組(1.09±0.55)％及陰性對(duì)照組(1.58±0.67)％比較明顯增加（P＜0.01）；半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組中Bax mRNA的表達(dá)比值為(0.32±0.02)，高于空白對(duì)照組(0.22±0.02)及陰性對(duì)照組(0.25±0.02)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Bcl-2mRNA的表達(dá)比值在實(shí)驗(yàn)組為(0.77±0.03)、空白

5、對(duì)照組為(0.75±0.03)、陰性對(duì)照組為(0.75±0.01)，其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；Caspase-3酶活性檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染PHY106-CHBV后可活化Caspase-3，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。NHMC細(xì)胞與人外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可檢測(cè)到HBsAg和HBeAg的高表達(dá)。MTT結(jié)果顯示NHMC細(xì)胞增殖受抑制。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示NHMC細(xì)胞凋亡率增加。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率(5.35