海參皂苷fuscocinerosideA抑制人腦膠質母細胞瘤U251細胞生長實驗研究.pdf

1、腦膠質細胞瘤是顱內最常見的腫瘤，它起源于正常的星形細胞或其前體祖細胞；而膠質母細胞瘤是最兇險、也是最常見的一種惡性膠質瘤，它在腦實質彌漫性浸潤的特性加上對普通化療藥物的相對耐藥性以及射線的不敏感性，導致目前包括外科治療在內的各種綜合治療效果均不佳，其中位生存期據(jù)文獻統(tǒng)計只有9～12個月，迫切需要新的治療方案或新的敏感藥物問世。海參廣泛存在于我國的海洋中，它的主要次生代謝產(chǎn)物三萜皂苷不僅具有抗病毒、抗真菌及抗凝血等活性，而且其抗癌作用也很

2、顯著。FuscocinerosideA系從棕環(huán)海參(holothuria fuscocinerea jaeger)代謝物中新分離出的一種三萜苷，在藥物篩選實驗中表現(xiàn)出對腫瘤細胞有很強的殺傷作用，但其作用機制尚未清楚。本文就海參皂苷fuscocinerosideA對人源性膠質母細胞瘤U251細胞系增殖的抑制作用進行研究，并探討其作用機制，為fuscocinerosideA作為抗腫瘤新藥的開發(fā)及臨床應用提供理論依據(jù)。
　　實驗一，低劑

3、量fuscocinerosideA對人腦膠質母細胞瘤U251細胞的體外生長影響及主要作用機制
　　四甲基偶氮唑藍(MTT)細胞增殖實驗顯示fuscocinerosideA對人腦膠質母細胞瘤U251細胞有顯著的生長抑制作用，有明顯的劑量和時間依賴性；fuscocinerosideA作用U251細胞48h的IC50及IC75分別為7.8±0.3μM（**P<0.01）和15.4±0.5μM（**P<0.01）；而fuscocinero

4、sideA對正常膠質細胞毒性作用甚微，僅在本實驗處理的最大劑量32μM經(jīng)過72h，表現(xiàn)出有統(tǒng)計學差異的變化，生存率降為82.3％（料P<0.01）；說明在正常膠質細胞能夠耐受的劑量窗內即能對U251膠質母細胞瘤細胞有明顯的殺傷作用。
　　與陰性對照相比，高于4μM的fuscocinerosideA對U251膠質母細胞瘤細胞的生長抑制更具有統(tǒng)計學意義（**P<0.01）。本實驗定義<4μMfuscocinerosideA作為實驗的低

5、劑量處理。
　　我們首先探討低劑量fuscocinerosideA對人腦膠質母細胞瘤U251細胞生長抑制的影響。與陰性對照組相比，2μMfuscocinerosideA對U251細胞的生長抑制無明顯的統(tǒng)計學意義(P>0.05)；用4μMfuscocinerosideA處理U251細胞，分別經(jīng)過24h、48h及72h的作用，存活率分別降為80.3％、75.5％及71.1％（*P<0.05）；鏡下觀察其形態(tài)學變化表現(xiàn)為細胞生長停滯，分

6、裂期細胞消失；為進一步探討低劑量fuscocinerosideA對膠質母細胞瘤細胞生長抑制的作用機制，我們用O、2μM及4μM的fuscocinerosideA分別處理U251細胞24h，并檢測其細胞周期的變化。結果表明，處理組U251細胞的Go/Gi期細胞百分比含量明顯增加，并隨處理濃度增大而增加，而S期和G2/M期細胞百分比含量減少，提示低劑量fuscocinerosideA能夠引起U251細胞發(fā)生Gi期阻滯；在實驗中未發(fā)現(xiàn)有“亞G

7、i峰”出現(xiàn)，表明未有顯著的凋亡發(fā)生，這進一步通過DNA瓊脂糖凝膠電泳得到證實。Westernblot結果顯示，未處理的U251膠質母細胞瘤細胞中p53、p27kip-l和p21waf－1蛋白表達含量較少，這與U251細胞的高度惡性腫瘤特性具有一致性；而經(jīng)4μM的fuscocinerosideA處理后的U251細胞中的p53、p27kip-l和p21waf－1蛋白表達都有明顯的增多，且伴有時間依賴性。上述結果說明低劑量fuscociner

8、osideA誘導的人腦膠質母細胞瘤U251細胞Gi期阻滯與p27kip-l的上調以及p53介導的p2waf-1的表達升高有關。
　　實驗二,高劑量fuscocinerosideA對人腦膠質母細胞瘤U251細胞的體外生長影響及主要作用機制
　　用7.8μM或更大劑量的fuscocinerosideA對U251膠質母細胞瘤細胞處理，流式細胞儀檢測細胞周期顯示不但有明顯的Go/Gi期阻滯，并且有典型的細胞凋亡特征一“亞Gi峰”的出

9、現(xiàn)；提示fuscocinerosideA對腫瘤細胞的抑制作用存在多條細胞內信號傳導途徑。用7.8μMfuscocinerosideA作用U251人腦膠質母細胞瘤細胞12h，即可在光鏡下觀察到部分細胞形態(tài)開始變化，出現(xiàn)貼壁細胞離壁、變圓等改變；而經(jīng)過作用24h或者更長時間，HE染色觀察到細胞皺縮，體積變小，胞漿明顯減少，胞核凝集濃染；Hoechst33342熒光染色觀察到染色質凝聚，有典型的核固縮和核碎裂；透射電鏡觀察到細胞微絨毛消失，溶

10、酶體增多，染色質濃集，邊集于胞膜下，呈團塊狀分布并有凋亡小體出現(xiàn)；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標記(TUNEL)檢測發(fā)現(xiàn)胞核在熒光顯微鏡下激發(fā)出黃綠色熒光，并有核碎裂、核固縮及凋亡小體出現(xiàn)；DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)凋亡細胞特征性的“梯狀”條帶；Westernblot結果顯示survivin在U251人腦膠質母細胞瘤細胞中高表達，同樣，這與U251細胞的腫瘤特性相符；而經(jīng)高劑量fuscocinerosideA處

11、理后survivin蛋白表達顯著降低；我們還發(fā)現(xiàn)高劑量fuscocinerosideA較低劑量的fuscocinerosideA更能顯著提高p53、p27kip-1和p21waf1蛋白的表達；同時caspase-3也被激活，裂解成19kD的活性片段，后者執(zhí)行最后的凋亡過程。說明高劑量fuscocinerosideA誘導的U251人腦膠質母細胞瘤細胞凋亡與p53的表達升高以及survivin的下調有關，二者可能與caspase-3的激活有

12、聯(lián)系。
　　結論：海參皂苷fuscocinerosideA能顯著地抑制人腦膠質母細胞瘤U251細胞的增殖：在較低劑量作用下，主要為抑制腫瘤細胞的增殖，阻滯細胞周期進展在Gi期；而在較高濃度下，fuscocinerosideA不但能誘導Gi/S細胞周期阻滯，還能誘導腫瘤細胞的大量凋亡，并且對正常膠質細胞的毒性甚微。FuscocinerosideA誘導的Gi/S期阻滯與p27kip-l的上調以及p53介導的p2lwa-的表達升高有關，