人椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的質(zhì)譜研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)采用了蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，包括雙向凝膠電泳，質(zhì)譜儀鑒定，對(duì)人的正常椎間盤(pán)組織內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)小分子蛋白進(jìn)行了初步的研究和分析，取得了有益的結(jié)果。 第一部分預(yù)實(shí)驗(yàn)牛椎間盤(pán)的細(xì)胞外基質(zhì)小分子蛋白的電泳分離及質(zhì)譜分析。 目的：通過(guò)對(duì)牛椎間盤(pán)進(jìn)行蛋白萃取，電泳分離以及質(zhì)譜分析檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可行性。 方法：使用Heinegard的方法對(duì)牛椎間盤(pán)進(jìn)行萃取，將萃取液上樣進(jìn)行SDS．PAGE梯度電泳分離蛋白質(zhì)，將分離的蛋白質(zhì)條

2、帶進(jìn)行染色切割，使用胰島素酶進(jìn)行消化，使用基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。 結(jié)果：結(jié)果顯示牛椎間盤(pán)萃取蛋白質(zhì)在分子量16-250Kd范圍內(nèi)能夠被很好的分離，通過(guò)質(zhì)譜鑒定可鑒定出蛋白質(zhì)種類，在所鑒定的蛋白質(zhì)中不含膠原蛋白的成分。說(shuō)明這種萃取方法不會(huì)破壞膠原網(wǎng)絡(luò)。 第二部分正常人椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)小分子蛋白的質(zhì)譜鑒定研究。 目的：通過(guò)使用預(yù)實(shí)驗(yàn)所確立的方法，對(duì)正常人的椎間盤(pán)組織進(jìn)行蛋白質(zhì)萃取，兩維電泳分離及質(zhì)譜

3、鑒定，來(lái)確立正常人椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)小分子蛋白的蛋白質(zhì)譜，為今后的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。 方法：使用Heinegard的萃取方法獲得萃取液，并通過(guò)超高速離心除去萃取液中的蛋白多糖成分，通過(guò)兩維電泳分離蛋白質(zhì)，把確認(rèn)的蛋白質(zhì)點(diǎn)切割并進(jìn)行胰島素酶消化，然后使用基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。 結(jié)果：雙向電泳顯示，纖維環(huán)和髓核的細(xì)胞外基質(zhì)小分子蛋白無(wú)明顯差異，纖維環(huán)和髓核中的小分子蛋白在pH3～10分子量16kd～250k

4、d．范圍內(nèi)能被很好地分離，對(duì)各蛋白質(zhì)點(diǎn)行質(zhì)譜儀鑒定，分別確定了其中相同的19種蛋白質(zhì)。 結(jié)論：雙向電泳可有效地分離椎間盤(pán)組織中細(xì)胞外基質(zhì)小分子蛋白，通過(guò)質(zhì)譜儀鑒定可以確定其組成成分，為進(jìn)一步研究椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)小分子蛋白的功能及在椎間盤(pán)病變中的改變和所起的作用打下基礎(chǔ)。 第三部分退變椎間盤(pán)和正常椎間盤(pán)組織的細(xì)胞外小分子蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果的對(duì)比研究。 目的：通過(guò)對(duì)退變的椎間盤(pán)組織的細(xì)胞外小分子蛋白進(jìn)行兩維電泳分離

5、和質(zhì)譜鑒定，和正常的人椎間盤(pán)組織細(xì)胞外小分子蛋白質(zhì)譜進(jìn)行對(duì)比，以圖發(fā)現(xiàn)不同。 方法：使用罹患椎間盤(pán)突出癥患者手術(shù)中取出的椎間盤(pán)組織進(jìn)行蛋白萃取，超高速離心取出蛋白多糖，兩維電泳分離，質(zhì)譜儀鑒定。 結(jié)果：在完全相同的條件下對(duì)退變的椎間盤(pán)組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示出了非常明顯的不同之處，既在兩維電泳凝膠上退變的椎間盤(pán)組織蛋白質(zhì)COMP的明顯缺失，經(jīng)過(guò)大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了不同之處的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，確定了下一步的研究對(duì)象。

6、第四部分針對(duì)COMP及其裂解片斷的研究。 目的：通過(guò)以往的實(shí)驗(yàn)中我們確立了以COMP為研究對(duì)象的研究方向。而某種蛋白的缺失主要是因?yàn)樗旧戆l(fā)上了裂解而造成的，在以往對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨的研究中發(fā)現(xiàn)，COMP的裂解位點(diǎn)一般是恒定的，故這部分實(shí)驗(yàn)的目的是尋找該蛋白的裂解片斷，確定其裂解位點(diǎn)，為制備其特異性的抗體做準(zhǔn)備。 方法：WesternBlot，硝酸銀染色及EUSA等方法。 結(jié)果：這部分實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行尚未得出可靠的結(jié)果，但本