MicroRNA調控細胞色素P450表氧化酶2J2基因的作用及機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　miRNAs(microRNA)是一類長度約21-23個核苷酸的單鏈RNA。miRNAs通常情況下與靶mRNAs的3’非編碼區(qū)序列(3’UTR)或5’UTR不完全互補結合,從而調控靶基因表達。近年來的研究表明,miRNAs通過調控原癌基因與抑癌基因的表達在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　CYP2J2是細胞色素P450表氧化酶家族中的一員,廣泛存在于人體心血管系統(tǒng)、肺、腎臟及肝臟組織中。CYP2

2、J2代謝花生四烯酸(Arachidonicacid,AA)生成4種環(huán)氧-二十碳三烯酸(ex-poxyeicosatrienoicacid,EETs),分別為5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET。在心血管系統(tǒng),EETs被認為是一種內皮源性超極化因子,促進內皮細胞增殖、遷移及類微血管結構形成,抑制血管平滑肌細胞遷移以及減輕炎癥反應。CYP2J2與EETs在腫瘤生長及轉移過程中也發(fā)揮重要作用。我們以前研究發(fā)現(xiàn)

3、,CYP2J2在多種腫瘤細胞系中高表達,而在正常細胞系中表達水平相對較低;并且CYP2J2在多種癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。
　　那么CYP2J2在癌組織和癌旁組織中的差異性表達是否與miRNAs的調控相關?miRNAs調控CYP2J2的作用機制是什么?目前這些問題尚未有答案。因此,本文研究了miRNAs對CYP2J2的調控作用,并探討了其在腫瘤中的作用及機制。
　　實驗方法:
　　1.利用生物信息學軟件預測可能與

4、CYP2J2的3’UTR結合的miRNAs,將CYP2J2的3’UTR克隆至熒光素酶報告基因載體(pMIR-Report載體)中。將miRNAs轉染至細胞中,檢測miRNAs對CYP2J23’UTR報告基因熒光素酶活性的影響,初步篩選可能與CYP2J2的3’UTR結合的miRNAs。將miRNAs在pMIR/CYP2J2-3’UTR上的可能結合位點突變,檢測熒光素酶活性,確認miRNAs與CYP2J2的3’UTR結合進而抑制熒光素酶活性

5、。
　　2.在多種腫瘤細胞系中轉染miRNAs,利用westernblot驗證miRNA對CYP2J2蛋白的影響;通過ELISA檢測miRNA對CYP2J2代謝產物14,15-EET的影響;
　　3.在腫瘤細胞中轉染miRNA,檢測其對細胞增殖、凋亡及CYP2J2相關信號通路的影響;
　　4.在裸鼠移植瘤模型中,研究miRNA對腫瘤生長、轉移及CYP2J2相關信號通路的影響;
　　5.收集人的腫瘤組織標本,通過實

6、時定量PCR及westernblot分別檢測癌組織及癌旁組織中的miRNA及CYP2J2表達水平,并分析二者之間的關系。
　　實驗結果:
　　1.miRNAs的初步篩選及驗證
　　通過熒光素酶報告基因實驗,我們發(fā)現(xiàn)let-7b顯著抑制pMIR/CYP2J2-3’UTR報告基因熒光素酶活性,而miR-140促進熒光素酶基因表達。通過westernblot證實let-7b顯著抑制腫瘤細胞中CYP2J2蛋白表達,ELISA提

7、示轉染let-7b顯著降低細胞培養(yǎng)基中CYP2J2代謝物14,15-EET濃度。
　　2.let-7b通過下調CYP2J2抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡
　　let-7b轉染人乳腺癌細胞、舌鱗癌細胞、肺癌細胞及宮頸癌細胞中,EDU細胞增殖實驗檢測發(fā)現(xiàn),let-7b抑制腫瘤細胞增殖,而AnnexinV/PI流式檢測表明let-7b明顯促進腫瘤細胞凋亡;CYP2J2特異性的抑制劑(C26)能明顯增強let-7b的腫瘤細胞生物效應,而

8、CYP2J2的代謝產物14,15-EET明顯抑制let-7b的腫瘤細胞生物效應;通過westernblot檢測發(fā)現(xiàn),let-7b通過影響CYP2J2的相關信號通路(pAKT/AKT、pERK/ERK及Bax)影響腫瘤細胞的增殖與凋亡。
　　3.let-7b通過下調CYP2J2抑制腫瘤的生長及轉移
　　在裸鼠乳腺癌移植瘤模型中,過表達let-7b顯著抑制腫瘤生長及轉移。我們對相關機制進行研究發(fā)現(xiàn),let-7b抑制腫瘤組織中CY

9、P2J2及pAKT/AKT、pERK/ERK表達、促進凋亡基因Bax及腫瘤轉移抑制基因nm-23的表達;同時每兩周檢測裸鼠24小時尿液中14,15-EET水平,發(fā)現(xiàn)let-7b顯著降低14,15-EET水平。
　　4.let-7b與CYP2J2在人腫瘤組織中的表達及二者之間聯(lián)系
　　檢測人肺癌組織及癌旁組織中l(wèi)et-7b與CYP2J2的表達水平,結果發(fā)現(xiàn)let-7b在癌組織中的表達顯著低于癌旁組織,而CYP2J2在癌組織中的

10、表達水平顯著高于癌旁組織,并且let-7b與CYP2J2在人腫瘤組織中的表達呈現(xiàn)相反的關聯(lián)。在人乳腺癌組織中,我們得到類似結果。
　　5.miR-140調控CYP2J2基因表達
　　通過熒光素酶報告基因實驗及實時定量PCR,我們發(fā)現(xiàn)miR-140顯著增加pMIR/CYP2J2-3’UTR報告基因熒光素酶活性及mRNA穩(wěn)定性;我們通過westernblot驗證,miR-140增加CYP2J2蛋白表達。
　　結論:

11、　　1.本研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在轉錄后水平調控CYP2J2表達:let-7b通過與CYP2J2的3’UTR結合抑制CYP2J2蛋白表達及其酶活性,而miR-140增加mRNA穩(wěn)定性,促進CYP2J2蛋白表達。
　　2.利用分子生物學及細胞生物學技術,對let-7b在體內、體外對腫瘤生長的作用及其機制進行了研究,我們發(fā)現(xiàn):
　　(1)let-7b通過調控CYP2J2,抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡;
　　(2)let