sIL-16在大腸桿菌中的表達(dá)及活性測(cè)定.pdf

1、用PCR法擴(kuò)增本室保存的sIL-16 cDNA片段,選擇NdeI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)定向插入含T7啟動(dòng)子同時(shí)帶有6個(gè)組氨酸序列表達(dá)標(biāo)簽的載體pET28a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-sIL16,得到陽(yáng)性克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),篩選表達(dá)菌株.觀察不同溫度下菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物可溶情況,選擇最適宜溫度進(jìn)行表達(dá).表達(dá)產(chǎn)物超聲碎菌,離心后上清過(guò)Ni<'2+>鏊和層析柱,根據(jù)咪唑梯度變化進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的純化.表達(dá)產(chǎn)物與淋巴細(xì)胞共

2、同孵育一段時(shí)間,通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察它對(duì)細(xì)胞表面某些分子表達(dá)的影響和它對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激作用.結(jié)論:從培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞提取IL-16 RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,利用高效表達(dá)載體pET28a(+)在sIL-16的N端添加了6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽,同時(shí)受控于T7啟動(dòng)子的調(diào)控下,使蛋白得以高效表達(dá)并方便純化.進(jìn)行低溫誘導(dǎo)減弱蛋白分子表面疏水基的相互作用,有利于蛋白正確折疊形成可溶性天然的空間結(jié)構(gòu).與rIL-16共孵育的PBMC表面IL-2R的表達(dá)水平