復方丹參滴丸、美托洛爾、卡維地洛和氨氯地平對動脈粥樣硬化斑塊消退和穩(wěn)定作用的研究.pdf

1、背景：冠心病是嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，其病理基礎是動脈粥樣硬化(Atherossclerosis，AS)。研究表明AS是一個穩(wěn)定期和不穩(wěn)定期交替的非線性過程，這一過程取決于斑塊的易損性。易損斑塊(Vulnerable Plaque)可導致斑塊破裂和血栓形成，臨床上表現(xiàn)為急性冠狀動脈綜合征(Acute CoronarySyndrome，ACS)。因此，對于動脈粥樣硬化早期診斷、穩(wěn)定和消退斑塊具有重要的臨床意義。 已經(jīng)證實

2、AS是一個多種致病因素導致的血管壁發(fā)生級聯(lián)反應的慢性炎癥過程。炎性因子標志物對ACS的診斷作用引起了國內外許多學者的關注，如：高敏C反應蛋白(hsC-RP)、細胞間黏附因子-1(ICAM-1)、細胞血管間黏附因子-1(VCAM-1)、基質金屬蛋白酶(MMPs)等。晚近，關于妊娠相關血漿蛋白A(PAPP-A)的研究發(fā)現(xiàn)，PAPP-A與斑塊的炎性活動存在相關性，有可能作為斑塊炎性活動的重要評價指標。 以往的研究表明，他汀類和ACEI

3、類藥物具有穩(wěn)定斑塊的作用。近年來，隨著臨床研究結果的公布β-受體阻滯劑和鈣拮抗劑對動脈粥樣硬化斑塊的消退作用引起很多學者關注，但是具體作用機制尚不完全清楚。研究證實中藥復方丹參滴丸可以影響脂質的代謝，但其對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定和消退的作用機制尚需進一步研究。因此，本研究擬將復方丹參滴丸、美托洛爾、卡維地洛和氨氯地平用于兔動脈粥樣硬化模型中，觀察這些藥物對斑塊穩(wěn)定和消退的療效并探討其分子生物學機制。 目的： 1．觀察復方

4、丹參滴丸、美托洛爾、卡維地洛、氨氯地平對動脈粥樣硬化斑塊的消退和穩(wěn)定作用并探討其分子生物學機制。 2．探討新型炎性因子PAPP-A在預測動脈粥樣硬化易損斑塊中的作用。 研究方法： 1．模型的建立：60只雄性新西蘭純種大白兔，應用球囊損傷腹主動脈，高膽固醇(1％)飼養(yǎng)12周。12周末，隨機分成六組，分別為小劑量復方丹參滴丸組(5粒/天/只)、大劑量復方丹參滴丸組(10粒/天/只)、美托洛爾組(25毫克/天/只

5、)、卡維地洛組(15毫克/天/只)、氨氯地平組(5毫克/天/只)、自然消退組，同時改為普通飲食。24周末各組分別在腹主動脈動脈粥樣硬化斑塊處轉染100μl 2.245×10<'9>pfu/ml的Ad-p53重組載體。25周末，給予各組實驗兔中國斑點蝰蛇毒(Chinese Russell's viper venom，CRVV)以及組胺進行藥物觸發(fā)，以促進斑塊破裂。 2．血液生化指標及炎性因子的檢測：各組實驗兔分別于實驗開始、12周

6、末和24周末，于清晨空腹稱重后，經(jīng)腹壁靜脈采血，檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。于實驗開始、12周末和25周末測量血液中一氧化氮(NO)、超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平。應用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定hsC-RP、PAPP-A的水平。 3．高頻超聲檢查：各組實驗兔分別于實驗開始、12周末和25周末應用體表超聲檢測腹主動脈收縮

7、期內徑(Ds)、內膜-中層厚度(IMT)、腹主動脈血流峰值速度(Vp)、血流剪切率(SR)和聲學密度(AIIc％)。 4．血管內超聲檢查：各組實驗兔分別于24周末和處死前應用血管內超聲技術測量血管外彈力膜面積(EEMA)、管腔面積(LA)和斑塊面積(PA)，同時根據(jù)PA和EEMA計算管腔面積狹窄百分比(LAS％)。 5．組織病理學檢測：觀察基因轉染部位斑塊破裂及血栓形成的發(fā)生率，測量易損斑塊處血管重構情況。利用HE和

8、油紅O染色，觀察斑塊的形態(tài)學特征，鏡下測量纖維帽及內中膜的厚度；masson染色觀察斑塊內部膠原纖維分布狀況；應用妊娠血漿相關蛋白A(PAPP-A)、細胞間黏附因子-1(ICAM-1)、細胞血管間黏附因子-1(VCAM-1)、基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、金屬蛋白酶組織抑制物(TiMP-1)的單克隆抗體、RAMll單克隆抗體和α-actin單克隆抗體對腹主動脈粥樣硬化斑塊進行組織免疫組織化學染色，以明確斑塊處各個炎性因子的表達以及

9、巨嗜細胞和平滑肌激動蛋白的分布情況。電鏡觀察斑塊內皮細胞和平滑肌細胞的結構。 6．實時定量PCR技術：檢測各組實驗兔腹主動脈粥樣硬化斑塊處VCAM-1、ICAM-1、MMP-1和TIMP-1的mRNA表達水平。 7．免疫印跡(Westem blot)技術：檢測各組實驗兔腹主動脈粥樣硬化斑塊處VCAM-1、ICAM-1、MMP-1和TIMP-1的蛋白質表達情況。 8．斑塊易損性的危險性分析：Logistic

10、回歸分析對斑塊破裂組和未破裂組的體重、血清學指標、體表超聲指標、AD值、IVUS測值等指標分析進行多變量Logistic回歸分析，以篩選斑塊易損性的預測指標。 9．統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示，采用SPSSl3.0分析軟件，計量資料采用t檢驗及方差分析，三組以上均數(shù)有顯著性差異時，采用兩兩比較q檢驗；變量之間的相關關系采用直線回歸相關分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 結果： 1．模型的建立：

11、60只新西蘭大白兔經(jīng)過球囊拉傷以及高脂飲食(1％)12周后，共有8只動物意外死亡。有52只新西蘭大白兔進入藥物干預階段，小劑量復方丹參滴丸組有9只，大劑量復方丹參滴丸組9只，卡維地洛組9只，美托洛爾組8只，氨氯低平組9只，自然消退組8只。24周術，各組實驗兔的存活情況為：小劑量復方丹參滴丸組8只，大劑量復方丹參滴丸組9只，卡維地洛組7只，美托洛爾組8只，氨氯地平組8只，自然消退組7只。死亡原因分別為：麻醉意外、腹瀉、感染或者原因不明。

12、 2．各組實驗兔體重：12周末實驗兔體重比基礎狀態(tài)增加(P<0.01)，24周術各組體重與12周末比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 3．血脂水平：與自然消退組比較，氨氯地平組、大劑量復方丹參滴丸組、卡維地洛組和美托洛爾組TC和LDL-C顯著降低(P<0.05)，小劑量復方丹參滴丸組有降低趨勢，未達到統(tǒng)計學意義：TG降低僅氨氯地平組降低達到統(tǒng)計學差異(P<0.05)；大劑量復方丹參滴丸組和氨氯地平組HDL-

13、C升高達到統(tǒng)計學意義(P<0.05)，美托洛爾組HDL-C降低達到統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 4．血液指標：與自然消退組相比較，各治療組hsC-RP和MDA都有不同程度降低(P<0.05)；SOD和NO各組都有不同程度的升高(P<0.05)，其中以大劑量復方丹參滴丸組最為明顯。 5．體表超聲：與自然消退組比較，各治療組僅有小劑量復方丹參滴丸組IMT未達到統(tǒng)計學意義的降低(P>0.05)，降低幅度由大到小依次為氨氯地

14、平組、卡維地洛組、大劑量復方丹參滴丸組、美托洛爾組、小劑量復方丹參滴丸組和自然消退組：美托洛爾組和卡維地洛組Vp降低達到統(tǒng)計學意義(P<0.01)；AIIc％各組升高均達到統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以美托洛爾組升高最明顯；SR僅美托洛爾組降低達到統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而復方丹參滴丸組由增加的趨勢，其中小劑量復方丹參滴丸組達到統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 6．血管內超聲：與自然消退組比較，各治療組LAS％明顯下降(P<0.

15、05)。藥物觸發(fā)后，自然消退組斑塊破裂4例，破裂率57％；小劑量丹參滴丸組破裂3例，破裂率37％；大劑量丹參滴丸組2例，破裂率22％；美托洛爾組2例，破裂率25％，氨氯地平組2例，破裂率25％；卡維地洛組1例，破裂率14％。 7．病理學結果：與自然消退組比較，各治療組ICAM-1、VCAM-1、MMP-1、FIMP-l和RAMll的表達均減少，而a-actin的表達增加；各治療組油紅O著色比自然消退組淺；與自然消退組比較，

16、各個治療組纖維帽的厚度都有不同程度的升高(P<0.05)由大到小依次為美托洛爾組、大劑量復方丹參滴丸組、小劑量復方丹參滴丸組、氨氯地平組、卡維地洛組和自然消退組；內中膜厚度不同程度的減少(P<0.05)。 8．實時定量PCR檢測：與自然消退組比較，各治療組ICAM-1、VCAM-1、MMP-1、TIMP-1的mRNA表達都有不同程度的減少(P<0.01)。 9．免疫印跡(Western blot)檢測：與自然消退組比較，

17、各治療組ICAM-1、VCAM-1、MMP-1、lIMP-1都有不同程度的減少。 10.PAPP-A相關性分析：PAPP-A與血液hsC-RP、血管內超聲LAS％以及腹主動脈IMT相關，其相關系數(shù)R<'2>分別為0.424、0.112和0.339，其P值均小于0.01。 11.斑塊易損性的危險性分析：Logistic回歸結果顯示IVUS測值PA，血清指標PAPP-A和hsC-RP，以及斑塊的IMT與斑塊破裂關系密切

18、，是預測斑塊易損性的重要指標。 結論 1．在動脈粥樣硬化斑塊兔模型中，氨氯地平、美托洛爾、卡維地洛和復方丹參滴丸可以起到穩(wěn)定和消退斑塊的作用，以氨氯地平作用最佳。 2．斑塊內脂質的減少、巨嗜細胞分布減少、抑制氧化應激和炎癥因子的表達是四種藥物消退實驗兔動脈粥樣硬化斑塊的主要機制；調節(jié)脂質代謝、抑制炎性反應、減少血流速度、調節(jié)血流剪切率是藥物穩(wěn)定實驗兔動脈粥樣硬化斑塊的主要機制。 3．復方丹參滴丸主要通過調

19、節(jié)血脂、抑制氧化應激和炎癥因子的表達穩(wěn)定和消退動脈粥樣硬化斑塊。美托洛爾和卡維地洛主要通過降低血流剪切率、巨嗜細胞分布減少和調節(jié)炎癥因子的表達穩(wěn)定和消退動脈粥樣硬化斑塊。氨氯地平作用較廣泛，調節(jié)血脂、減少巨嗜細胞的分布、抑制氧化應激和炎癥因子的表達。 4．高頻超聲檢查可作為動態(tài)觀察動脈粥樣硬化斑塊的變化、識別斑塊破裂的可靠性方法。 5．PAPP-A與IMT、hsC-RP以及LAS％相關，可以作為動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的