HBx通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活趨化因子MIG表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 1.探討HBV是否能誘導(dǎo)肝細(xì)胞分泌趨化因子MIG，以及篩選HBV編碼的七個(gè)蛋白中能顯著影響MIG表達(dá)的蛋白。
　　 2.探討HBx在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MIG表達(dá)的詳細(xì)分子機(jī)制，篩選出HBx激活的核轉(zhuǎn)錄因子。
　　 3.探討HBx蛋白誘導(dǎo)的MIG是否具有趨化體外培養(yǎng)活化PBL的生物學(xué)功能。
　　 方法：
　　 一. HBV能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分泌MIG：
　　 1.將包含HBV全基因組的

2、質(zhì)粒pBlue-HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，RT-PCR和ELISA檢測(cè)MIG表達(dá)變化。
　　 2.將包含了HBV編碼的七個(gè)基因的質(zhì)粒pCMV-S，pCMV-preS1，pCMV-preS2，pCMV-Hbe，pCMV-HBc，pCMV-HBx，pCMV-HBp分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，RT-PCR和ELISA檢測(cè)MIG表達(dá)變化。
　　 3.構(gòu)建包含MIG全長(zhǎng)啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒（-983/+33）MIG，與HBV七個(gè)基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝癌

3、細(xì)胞，熒光素酶技術(shù)檢測(cè)MIG啟動(dòng)子活性變化。
　　 4.將(-983/+33)MIG與不同劑量pCMV-HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，熒光素酶技術(shù)檢測(cè)不同劑量的HBx蛋白激活MIG基因啟動(dòng)子的水平。
　　 二. HBx誘導(dǎo)MIG表達(dá)的分子機(jī)制：
　　 1.構(gòu)建系列截短的MIG啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒(-495/+33)MIG，(-185/+33)MIG，(-129/+33)MIG，與pCMV-HBx共轉(zhuǎn)染，熒光素酶技術(shù)分析

4、MIG啟動(dòng)子活性變化。
　　 2.分別突變NF-κB兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建突變質(zhì)粒NF-κB1 MUT，NF-κB2 MUT，與pCMV-HBx共轉(zhuǎn)染，熒光素酶技術(shù)分析突變MIG啟動(dòng)子活性變化。
　　 3.將pCMV-HBx與 (-985/+33)MIG共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，用不同濃度的MG-132（NF-κB抑制劑）處理細(xì)胞，檢測(cè)MIG啟動(dòng)子活性變化。
　　 4.將NF-κB亞基p65和p50表達(dá)質(zhì)粒pCMV-p

5、65、pCMV-p50分別與(-495/+33)MIG或者NF-κB2 MUT共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，熒光素酶技術(shù)檢測(cè)MIG啟動(dòng)子活性變化，ELISA檢測(cè)MIG蛋白表達(dá)的變化。將pCMV-HBx轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，分別提取胞質(zhì)以及核內(nèi)的總蛋白，Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p65在核內(nèi)和核外的表達(dá)變化；另外，采用FITC標(biāo)記的二抗處理和DAPI染細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察p65在胞漿和核內(nèi)表達(dá)變化。
　　

6、5.將pCMV-HBx或pCMV-tag2轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，獲得細(xì)胞核抽提物，用濃度為標(biāo)記探針100倍的未標(biāo)記探針作為競(jìng)爭(zhēng)劑進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NF-κB是否能直接與MIG啟動(dòng)子上NF-κB位點(diǎn)結(jié)合。
　　 三.HBx誘導(dǎo)產(chǎn)生的MIG對(duì)體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的趨化作用：
　　 1.將pCMV-HBx和空載體pCMV-Tag2分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，48 h后分別取細(xì)胞分泌上清，通過(guò)趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分泌產(chǎn)物對(duì)

7、PBL遷移的影響。
　　 2.將pCMV-HBx轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，加入10μM MG-132處理細(xì)胞，取細(xì)胞分泌上清，通過(guò)趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分泌產(chǎn)物對(duì)PBL遷移的影響。
　　 3.將pCMV-p65、pCMV-p50分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，或?qū)CMV-p65、pCMV-p50共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，取細(xì)胞培養(yǎng)上清通過(guò)趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞分泌產(chǎn)物對(duì)PBL遷移的影響。
　　 4.分別轉(zhuǎn)染pCMV-Tag2、pCMV-H

8、Bx、pCMV-p65、pCMV-p50，或?qū)CMV-p65、pCMV-p50共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。取細(xì)胞培養(yǎng)上清加入10 μg抗MIG的抗體中和MIG表達(dá)，然后通過(guò)趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞分泌產(chǎn)物對(duì)PBL遷移的影響。
　　 結(jié)果：
　　 一.HBV誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分泌MIG：
　　 1.與空載體組相比，轉(zhuǎn)染pBlue-HBV后肝癌細(xì)胞中MIG的mRNA水平顯著上調(diào)，分泌的MIG蛋白量顯著增加。
　　 2.HB

9、V七個(gè)功能蛋白S，preS1，preS2，Hbe，HBc，HBx以及P蛋白中，僅有HBx蛋白可以明顯地誘導(dǎo)趨化因子MIG表達(dá)，S蛋白亦可以輕度激活MIG表達(dá)，其他HBV蛋白對(duì)MIG表達(dá)幾乎沒(méi)有任何影響。
　　 3.HBV七個(gè)功能蛋白中，僅有HBx蛋白可以明顯地激活趨化因子MIG啟動(dòng)子活性，與空載體組相比，轉(zhuǎn)染pCMV-HBx后MIG啟動(dòng)子活性增加3.45倍；其他蛋白對(duì)MIG基因啟動(dòng)子活性幾乎沒(méi)有任何影響。
　　 4.隨著

10、HBx蛋白表達(dá)量的增加，MIG啟動(dòng)子的活性隨之增加。
　　 二. HBx誘導(dǎo)MIG表達(dá)的分子機(jī)制：
　　 1.分別以共轉(zhuǎn)染空載體pCMV-Tag2和報(bào)告基因細(xì)胞內(nèi)MIG啟動(dòng)子活性為100％，HBx蛋白激活(-985/+33)MIG的活性達(dá)3.64倍，而截短的MIG啟動(dòng)子(-495/+33)MIG，(-185/+33)MIG，(-129/+33)MIG活性分別達(dá)3.81，4.09，1.30倍。由于截短掉-185－-129后

11、，HBx蛋白對(duì)MIG啟動(dòng)子的激活能力大大降低，因此，初步推斷-185－-129位點(diǎn)在HBx蛋白誘導(dǎo)MIG表達(dá)的過(guò)程中起重要作用。
　　 2.HBx蛋白可以激活野生型MIG啟動(dòng)子(-495/+33)MIG的活性達(dá)3.48倍，而突變的MIG啟動(dòng)子NF-κB1 MUT，NF-κB2 MUT和c/eBP MUT活性分別達(dá)3.12，1.43，2.78倍。由于突變掉NF-κB2結(jié)合位點(diǎn)后，HBx蛋白對(duì)MIG啟動(dòng)子的激活能力大大降低，因此推斷

12、NF-κB2結(jié)合位點(diǎn)在HBx蛋白誘導(dǎo)MIG表達(dá)的過(guò)程中起到重要作用。
　　 3.HBx蛋白可以明顯地激活MIG啟動(dòng)子活性，但是隨著加入的MG-132量的增加，這種激活現(xiàn)象被明顯的抑制，當(dāng)MG-132的濃度增加到25 uM時(shí)，其誘導(dǎo)作用幾乎消失。
　　 4.與空載體組相比，分別轉(zhuǎn)染pCMV-p65、pCMV-p50后，MIG啟動(dòng)子活性分別增高2.6和3.4倍；同時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-p65、pCMV-p50后，MIG啟動(dòng)子活性增

13、高5.8倍。然而，轉(zhuǎn)染pCMV-p65和pCMV-p50對(duì)突變體NF-κB2 MUT沒(méi)有任何作用。轉(zhuǎn)染pCMV-HBx后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，p65在核內(nèi)的量逐漸增多，而在核外的量卻逐漸減少。激光共聚焦結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體pCMV-Tag細(xì)胞內(nèi)NF-κB的p65亞基主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，而轉(zhuǎn)染pCMV-HBx細(xì)胞內(nèi)NF-κB的p65亞基由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。
　　 5.EMSA結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCMV-HBx的樣本存在遷移帶，而轉(zhuǎn)染空載

14、體的樣本未出現(xiàn)遷移帶，說(shuō)明轉(zhuǎn)染pCMV-HBx樣本中存在和標(biāo)記探針結(jié)合的蛋白；用濃度為標(biāo)記探針20倍或100倍的未標(biāo)記探針作為競(jìng)爭(zhēng)劑進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pCMV-HBx樣本 (lane 3或lane 4)的遷移帶隨競(jìng)爭(zhēng)劑濃度的增加則明顯減弱，說(shuō)明與探針結(jié)合是特異性的；當(dāng)樣本轉(zhuǎn)染pCMV-HBx并加MG-132處理后發(fā)現(xiàn)，隨抑制劑濃度增加，遷移帶則明顯減弱，說(shuō)明與探針結(jié)合的蛋白是NF-κB。ChIP實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染pCMV-HBx基因的

15、樣本，當(dāng)加入p65或p50的抗體時(shí)，可以通過(guò)PCR檢測(cè)到包含有NF-κB2結(jié)合位點(diǎn)的序列，但不加入任何抗體或者加入兔IgG對(duì)照抗體并沒(méi)有檢測(cè)到目的條帶；而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒pCMV-tag2的樣品，當(dāng)加入p65或p50的抗體時(shí)，也沒(méi)有檢測(cè)到目的條帶。
　　 三.HBx誘導(dǎo)產(chǎn)生的MIG對(duì)體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的趨化作用：
　　 1.轉(zhuǎn)染pCMV-HBx細(xì)胞上清的趨化活性是轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞上清趨化活性的5.19倍，說(shuō)明HBx誘導(dǎo)產(chǎn)物能

16、增強(qiáng)對(duì)活化的人PBL的趨化活性。
　　 2.加入NF-κB的抑制劑MG-132處理細(xì)胞后，分泌上清對(duì)PBL的趨化活性由5.19倍下降至1.94倍，說(shuō)明NF-κB在HBx蛋白誘導(dǎo)PBL遷移的過(guò)程中起著重要作用。
　　 3.與陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染pCMV-p65、pCMV-p50后培養(yǎng)細(xì)胞上清趨化活性分別增加3.2和4.0倍，共轉(zhuǎn)染pCMV-p65、pCMV-p50后培養(yǎng)細(xì)胞上清趨化活性增加6.9倍。由此可知，p65和p50的

17、過(guò)表達(dá)可以增加細(xì)胞分泌產(chǎn)物對(duì)PBL的趨化作用。
　　 4.轉(zhuǎn)染空載體pCMV-Tag2的細(xì)胞加入抗MIG抗體中和分泌的MIG后，對(duì)細(xì)胞上清對(duì)PBL的趨化能力沒(méi)有影響，而轉(zhuǎn)染pCMV-HBx的細(xì)胞在加入抗MIG抗體后，分泌上清對(duì)PBL的趨化能力明顯地下降。轉(zhuǎn)染pCMV-p65、pCMV-p50的細(xì)胞，以及共轉(zhuǎn)染p65和p50蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞在加入抗MIG抗體后，分泌上清對(duì)PBL的趨化能力均明顯下降。轉(zhuǎn)染pCMV-HBx的細(xì)胞

18、經(jīng)MG-132處理后，再加入抗MIG抗體處理細(xì)胞，其趨化PBL的能力較加對(duì)照抗體的細(xì)胞對(duì)PBL的遷移能力下降并不明顯。由此可知，誘導(dǎo)分泌的趨化因子MIG在PBL的遷移中起著重要作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.HBx蛋白顯著激活趨化因子MIG啟動(dòng)子活性，從而上調(diào)MIG mRNA和蛋白表達(dá)的量。
　　 2.HBx蛋白能激活NF-κB，使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，進(jìn)入細(xì)胞核的NF-κB可以結(jié)合在趨化因子MIG啟