受體相關蛋白在血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠動脈粥樣硬化和腹主動脈瘤中的作用.pdf

1、受體相關蛋白(Receptorassociatedprotein，RAP)在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達，它可以和多種蛋白結合，其中包括低密度脂蛋白受體相關蛋白(lowdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein，LRP1)、脂蛋白脂酶(lipoproteinlipase，LPL)、極低密度脂蛋白受體(verrlowdensitylipoproteinreceptor，VLDLR)和糖蛋白330(glycopr

2、otein330/megalin)。相關的研究表明，RAP可以在上述蛋白合成分泌過程中，與這些蛋白的前體結合，預防其在蛋白成熟前與其它細胞內(nèi)蛋白結合。RAP基因的缺失可能導致上述蛋白表達減低。因此，RAP也被稱為相關蛋白的分子伴侶，和RAP相關的蛋白中，LRP1具有對血管疾病的保護作用，如LRP1在血管平滑肌細胞、巨噬細胞和肝細胞中的表達缺失可以促進動脈粥樣硬化的發(fā)生；而LPL在巨噬細胞中表達缺失卻可以減少動脈粥樣硬化的發(fā)生，盡管上述蛋

3、白，尤其是LRP1，在心血管疾病中的作用已經(jīng)做了廣泛深入的研究，但關于RAP在心血管疾病中作用的研究，目前仍然是一片空白。本課題將采用RAP基因敲除小鼠，探討RAP在血管緊張素II(AngII)誘導的動脈粥樣硬化和腹主動脈瘤(AAAs)中的作用。 RAP基因敲除小鼠購買自Jackson實驗室。所有實驗小鼠均和C57BL6小鼠雜交繁殖10次以上，通過滲透性微泵慢性持續(xù)輸注AngII28天，誘導動脈粥樣硬化和腹主動脈瘤病變的發(fā)生，血

4、漿膽固醇濃度和脂蛋白的分布通過酶反應試劑盒和快速蛋白液相法(FastProteinLiquidChromatography,FPLC)檢測。Kent8尾動脈測壓系統(tǒng)測量小鼠尾動脈收縮壓。顯微鏡直視下，通過測量主動脈弓內(nèi)膜表面動脈粥樣硬化病變面積來量化動脈粥樣硬化(enfacemeasurement)。采用Image-Pro軟件量取腹主動脈腎動脈以上段最大的外徑作為AAAs的評估指標。動脈外徑大于正常值(約0.8mm)50％，定義為AAA

5、s。 首先，鼠系和年齡相當?shù)男坌孕∈?RAP+/+，n=11，RAP-/-，n=10)予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，并通過滲透性微泵輸注AngII(1000ng/kg/min)28天。結果表明，RAP基因敲除并不影響小鼠的體重和血總膽固醇水平。AngII輸注同時增加兩組小鼠尾動脈收縮壓(RAP+/+，177±7mmHg，RAP-/-，170±5mmHg，P=NS)。RAP基因敲除不增加AngII誘導的AAAs的發(fā)生。 然后，鼠系和年

6、齡相當?shù)腖DL受體基因敲除的雄性小鼠，同時分別是RAP+/+(n=20)或RAP-/-(n=17)小鼠予以高脂飲食。我們觀察高脂血癥時，小鼠動脈粥樣硬化和AAAs的變化。所有小鼠輸注500ng/kg/min的AngII28天。結果表明，實驗過程中兩組小鼠沒有明顯的體重差別。AngII輸注均升高兩組小鼠的尾動脈收縮壓(RAP+/+：171±6mmHg；RAP-/-:165±5mmHg；P=NS).在LDL受體基因敲除的背景下，RAP基因敲

7、除顯著升高血漿膽固醇濃度(RAP+/+:1122±40；RAP-/-：1500±56mg/dl；P<0.001)。FPLC和非線性擬合分析表明，RAP基因缺失導致了VLDL(RAP+/+:484±22；RAP-/-：713±55mg/dl；P=0.001)和IDL/LDL(RAP+/+：566±25；RAP-/-：757±42mg/dl；P<0.001)濃度的顯著升高，與此同時，降低了HDL(RAP+1+：75±3；RAP-/-：63±

8、4mg/dl；P=0.028)的濃度。盡管RAP基因敲除引起了上述致動脈粥樣硬化性血脂成分改變，RAP基因敲除小鼠主動脈弓的動脈粥樣硬化病變面積百分比，與RAP+/+小鼠相比，卻顯著降低(RAP+1+:：18.28±2.24％；RAP-/-:11.74±0.99mg/dl；P=0.041)。而兩組小鼠腹主動脈外徑?jīng)]有顯著差異(1.48±0.30versus1.25±0.15mm，P=NS)。 為區(qū)分是骨髓來源的細胞(主要是巨噬細

9、胞)還是血管壁中的原有的細胞(resident細胞，如血管平滑肌細胞，內(nèi)皮細胞)中的RAP基因，發(fā)揮的對動脈粥樣硬化和動脈瘤的調(diào)控作用，我們進行骨髓移植實驗。LDLR基因敲除小鼠以非致死劑量進行骨髓照射后，予以RAP+/+(n=24)或RAP-/-(n=25)骨髓細胞進行骨髓重建4周。骨髓重建后小鼠予高脂喂養(yǎng)并輸注500ng/kg/minAngII28天。實驗結果表明，骨髓來源的細胞特異性RAP基因缺失對小鼠的體重和血漿膽固醇沒有顯著影

10、響。AngII同時升高兩組小鼠尾動脈收縮壓(RAP+1+：168±3mmHg；RAP-/-：173±3mmHg；P=NS)。骨髓來源的細胞特異性RAP基因敲除并不降低小鼠主動脈弓動脈粥樣硬化面積百分比(RAP+1+：24.07±2.14％；RAP-/-：19.24±2.21mg/dl；P=0.124)。但是骨髓來源的細胞特異性RAP基因敲除卻導致了腹主動脈直徑的顯著升高(RAP+/+：0.99±0.04mm；RAP-/-：1.28±0.

11、12mm，P=0.01)，并增加AAAs的發(fā)生率(RAP+/+：4％；RAP-/-：41％，P=0.001)。 最后，我們通過體外實驗，檢測RAP，作為LRP1的伴侶蛋白，對LRP1表達的調(diào)控作用。Westernblotting顯示，RAP基因敲除完全阻斷成熟的LRP1蛋白在巨噬細胞中的表達。RAP基因敲除對血管平滑肌細胞中LPR1的表達沒有影響。免疫染色顯示，RAP基因缺失降低了LRP1在肝臟細胞中的表達。 通過上述實

12、驗，我們認為： 1.RAP細胞依賴性的調(diào)節(jié)LRP1的表達； 2.Resident細胞中的RAP，通過獨立于LRP1的方式，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生； 3.骨髓來源細胞中的RAP保護AngⅡ誘導的AAAs發(fā)生，但該作用需進一步研究證明。 我們的實驗結果具有如下的意義： 1.RAP調(diào)控LRP1的表達是細胞依賴性的，從而加深和豐富了人們對分子伴侶調(diào)控目標蛋白表達的認識。 2.通過嚴格的動物實驗，首