TIP30在腦膠質(zhì)瘤中的作用及臨床意義.pdf

1、背景:
　　 腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性神經(jīng)上皮細胞腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的50％。綜合發(fā)病年齡高峰在30-40歲之間。目前腦膠質(zhì)瘤的治療主要有手術(shù)、放療、化療、生物靶向治療等手段，但由于腫瘤生長速度快并呈浸潤性生長，以及對放化療介導的細胞凋亡不敏感等惡性生物學特性，總體治療療效不佳，復發(fā)率高，預后差，所以明確關(guān)鍵的致癌途徑，尋找腦膠質(zhì)瘤新的預后指標和治療靶點至關(guān)重要。TIP30(Tat-interactive protein30)

2、是一相對分子質(zhì)量為30KD的轉(zhuǎn)錄共分子，基因定位于人類第11號染色體，可與人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)轉(zhuǎn)錄輔助因子Tat蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)蛋白Tat的轉(zhuǎn)錄活性，從而特異性地提高HIV的增殖。近年來國內(nèi)外多項研究均提示TIP30其實是一種新的抑癌基因，它在人類正常組織如心、腦、肺、腎、胰腺中廣泛表達，但在乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、涎腺癌等多種惡性腫瘤中低表達甚至缺失。目前研究發(fā)現(xiàn)TI

3、P30主要是通過延緩細胞生長，誘導細胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，調(diào)節(jié)DNA損傷修復，調(diào)節(jié)細胞對葡萄糖的耐受性，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，增加腫瘤細胞對化療的敏感性等多種功能起到抑制腫瘤發(fā)展的作用。盡管TIP30在多種惡性腫瘤中的作用逐漸明朗，但目前有關(guān)TIP30與腦膠質(zhì)瘤之間的相關(guān)性報道仍較少，TIP30在腦膠質(zhì)瘤中是否也充當著抑癌基因的角色尚不清楚。表皮生長因子受體(epidermal growth factor Recepto

4、r，EGFR)是一種跨膜糖蛋白，分子量170Da，屬于酪氨酸激酶型受體，通過與EGF等配體結(jié)合后激活下游信號傳導通路如MAPK/ERK、PI3K/AKT等從而介導腫瘤細胞分化、生長、遷移、侵襲、黏附和細胞損傷修復等一系列過程。研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因在人腦惡性膠質(zhì)瘤中常常出現(xiàn)擴增、重排、突變和過度表達，其下游AKT、ERK等信號通路蛋白在也存在過表達與共表達，借助于信號轉(zhuǎn)導使細胞生長失控和轉(zhuǎn)化，并且與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。有關(guān)TIP30

5、與EGFR之間的關(guān)系目前也是研究的熱點。肖華等研究發(fā)現(xiàn)在TIP30基因敲除的小鼠中，EGFR下游通路上調(diào)，自發(fā)性肺腫瘤的發(fā)生率增高。進一步研究證實TIP30可與細胞膜上ACSL4、Endophilin B1等物質(zhì)形成復合物，影響早期內(nèi)涵體環(huán)節(jié)的EGFR分選，加速EGFR和配體EGF的分離，促進EGFR向溶酶體的分選和降解，從而終止EGFR下游信號通路的傳導，達到抑制腫瘤發(fā)展的作用。但是目前在腦膠質(zhì)瘤中TIP30與EGFR的相關(guān)關(guān)系尚未清

6、楚，TIP30是否也可以通過下調(diào)EGFR及其下游信號傳導通路來發(fā)揮其生物學作用，需要我們進一步研究證實。
　　 目的:
　　 本實驗旨在研究TIP30在腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中蛋白表達情況的差異，及其與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征、預后之間的關(guān)系。然后進一步在細胞水平驗證TIP30對腦膠質(zhì)瘤細胞生長、遷移、侵襲、凋亡等功能的影響。最后探討TIP30與EGFR兩者在腦膠質(zhì)瘤中的相關(guān)關(guān)系。
　　 材料與方法:
　

7、　 1.主要的實驗材料
　　 1.1組織標本
　　 收集南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院2006至2011年腦外科收治的92名腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后石蠟病理組織。其中男性40人，女性52人，中位年齡35歲。所有病人術(shù)前未進行放化療，且均經(jīng)病理組織學診斷為腦膠質(zhì)瘤。其中星型膠質(zhì)細胞瘤42例，少突膠質(zhì)細胞瘤25例，膠質(zhì)母細胞瘤25例。病理分級WHOⅠ-Ⅱ級42例，Ⅲ-Ⅳ級50例。腫瘤大小≥5cm有47例，＜5cm有45例。另取10例癲癇

8、病人手術(shù)后腦組織作為對照。本實驗已經(jīng)通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的同意批準。
　　 1.2實驗試劑
　　 兔抗人的TIP30多克隆抗體，兔抗人EGFR單克隆抗體，兔抗人的pAKT和pERK單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗，DAB顯色劑，蘇木素，無水乙醇，95％酒精，1％鹽酸酒精，RIPA裂解液，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR GreenⅠ熒光定量試劑盒，胎牛血清，high-glu

9、coseDMEM，轉(zhuǎn)染試劑lipo2000，質(zhì)粒提取試劑盒，MTT，Matrigel基底膠，Annexin(Ⅴ)-FITC細胞凋亡檢測試劑盒等。
　　 1.3實驗儀器
　　 恒溫孵箱，流式細胞儀，電泳槽，PCR擴增儀，冰箱，光學顯微鏡，高速離心機，電子天平秤，載玻片，蓋玻片，培養(yǎng)皿，吸管，微量移液器，試管，EP管，凍存管等。
　　 2.細胞培養(yǎng)
　　 選取腦膠質(zhì)瘤細胞株U87進行實驗，培養(yǎng)條件為10％胎牛

10、血清+高糖的DMEM，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。顯微鏡下可見細胞胞體呈多角形，突起細長。
　　 3.實驗流程
　　 3.1 TIP30和EGFR蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達采用免疫組織化學法檢測92例腦膠質(zhì)瘤和10例對照組腦組織石蠟切片中TIP30和EGFR表達情況的差異。并且分析兩者蛋白表達的相關(guān)關(guān)系。切片經(jīng)脫蠟、抗原修復及血清封閉后，加入TIP30抗體或EGFR抗體，4℃過夜。次日復溫45min后PBS沖洗，加入

11、二抗，室溫下孵育1h，顯色，蘇木素復染，顯微鏡下觀察。評分標準采用半定量雙盲法，即400倍高倍鏡下隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞。染色結(jié)果分別以顯微鏡下觀察細胞顯色程度和比例計分。細胞顯色程度:無顯色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分;顯色細胞比例:＜10％計0分，10％～30％計1分，31％～60％計2分，＞60％計3分。兩項分值的乘積＞2分者視為TIP30或EGFR蛋白陽性表達。
　　 3.2 TI

12、P30和EGFR蛋白表達與腦膠質(zhì)瘤病人臨床病理特征及預后之間的關(guān)系收集92例腦膠質(zhì)瘤病人的臨床資料，按照患者的性別（男、女）、年齡(≥35、＜35歲）、病理類型（星型膠質(zhì)細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤）、病理分級（WHOⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級）、腫瘤大小(≥5cm、＜5cm)對TIP30和EGFR進行分層分析。同時電話隨訪病人的生存情況，進行TIP30單因素和多因素生存分析，評價TIP30是否是腦膠質(zhì)瘤病人的獨立預后指標。
　　

13、 3.3 TIP30對腦膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學功能的影響采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法使腦膠質(zhì)瘤細胞株U87過表達TIP30，并設(shè)立空載體對照組和未處理組，免疫印跡及RT-PCR驗證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。之后進行細胞生物學功能實驗，其中包括MTT比色法檢測細胞生長增殖情況;劃痕實驗檢測細胞遷移能力;transwell實驗檢測細胞侵襲能力;流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，評價TIP30對腦膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學功能的影響。
　　 3.

14、4 TIP30與EGFR在腦膠質(zhì)瘤中的相關(guān)關(guān)系慢病毒轉(zhuǎn)染使腦膠質(zhì)瘤細胞株U87過表達TIP30后，免疫印跡的方法檢測過表達株中EGFR及其下游信號傳導通路中的兩種主要蛋白pAKT和pERK的表達量是否也隨之改變，初步探討TIP30是否可以影響EGFR及其下游通路來發(fā)揮其生物學作用。
　　 4.數(shù)據(jù)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。TIP30及EGFR在腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織之間、兩者與患者臨床病理參數(shù)之間的比較

15、采用Pearsonx2檢驗;體外細胞實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標準差的形式表示（實驗重復三次，至少兩次實驗是在同一實驗條件下完成），組間的比較采用Student-t檢驗。相關(guān)性采用Sperman相關(guān)分析，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，多因素生存分析采用COX風險比例回歸模型法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.TIP30和EGFR蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達92例腦膠質(zhì)瘤組織中，TIP3

16、0的陽性率為54.3％(50/92)，而正常腦組織中的陽性率達90.0％(9/10)，差異具有顯著性(P=0.03)。相反，EGFR在腦膠質(zhì)瘤中的表達陽性率明顯高于正常腦組織(57.6％ vs20.0％，P=0.04)。Sperman相關(guān)性分析提示TIP30與EGFR蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達存在著負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.57，P＜0.01。
　　 2.TIP30和EGFR蛋白表達與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系 TIP30

17、蛋白表達同腦膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別無關(guān)，而與病理類型、腫瘤分級和腫瘤大小呈負相關(guān)(P＜0.05)。單因素生存分析提示TIP30陽性表達組總生存時間明顯長于陰性表達組（26.4 vs20.6個月，P=0.019）。多因素分析則表明TIP30也是腦膠質(zhì)瘤患者的獨立預后指標之一(P=0.043)。與此相反，EGFR蛋白表達則與腦膠質(zhì)瘤患者惡性程度較高的病理類型、分化差的高級別腫瘤和較大的腫瘤大小相關(guān)(P＜0.05)。EGFR表達陽性的患者的總

18、生存時間也明顯短于表達陰性者（21.3 vs27.0個月，P=0.021）。
　　 3.TIP30抑制腦膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移、侵襲和促進細胞凋亡慢病毒轉(zhuǎn)染使腦膠質(zhì)瘤細胞株U87穩(wěn)定過表達TIP30后，腫瘤細胞無論是生長增殖速度、遷移速度還是侵襲的速度都較對照組明顯減慢，但細胞早期凋亡的數(shù)量過表達組卻較對照組明顯增多，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.TIP30負性調(diào)節(jié)EGFR及其下游信號傳導通路蛋白的表達

19、慢病毒轉(zhuǎn)染使腦膠質(zhì)瘤細胞株U87穩(wěn)定過表達TIP30后，EGFR蛋白的表達量較空載體對照組明顯減少，除此之外，EGFR下游信號通路蛋白pAKT和pERK的表達量也隨之下調(diào)，說明TIP30可以負性調(diào)節(jié)EGFR及其下游信號傳導通路的蛋白表達。
　　 結(jié)論:
　　 1.TIP30在腦膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)，它與患者的年齡、性別無關(guān)，但與患者病理類型、分級、腫瘤大小和總生存時間密切相關(guān)，同時也是腦膠質(zhì)瘤病人一個獨立的預后因素。