SATB1在肝星狀細胞活化和大鼠肝纖維化形成中作用機制的研究.pdf

1、【研究背景與目的】
　　肝星狀細胞活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。既往研究表明，TGF-β1和MAPK信號通路的異常激活與肝星狀細胞活化及肝纖維化發(fā)展密切相關。SATB1是一種核基質結合蛋白，調控超過1000種基因的轉錄及表達；其參與介導TGF-β1及MAPK等重要細胞信號轉導通路，并影響細胞增殖、凋亡、遷移等生物學過程。但目前關于SATB1在肝星狀細胞活化及肝纖維化形成中的作用尚無研究報道。因此，我們擬在體外細胞水平研究SATB1對肝

2、星狀細胞活化、增殖、遷移和粘附的影響及其機制，以及在體內動物水平研究SATB1對大鼠肝纖維化形成的影響，探索SATB1在肝星狀細胞活化及肝纖維化形成中的作用及機制。
　　【方法】
　　利用硫代乙酰胺建立肝纖維化大鼠模型；免疫組織化學、激光共聚焦、real-time PCR和Western blot檢測正常及纖維化大鼠肝組織中SATB1和α-SMA的表達定位及含量變化。建立大鼠肝星狀細胞活化體內及體外模型，real-time

3、PCR和Western blot檢測SATB1和α-SMA的表達變化。利用siRNA及SATB1真核表達質粒（或SATB1腺病毒表達載體）建立SATB1低表達和過表達肝星狀細胞株（人肝星狀細胞株LX-2和大鼠HSCs）。Real-time PCR和Western blot法檢測SATB1表達變化對HSCs活化相關因子α-SMA、CTGF、COL1A1、COL3A1的影響。CCK-8及real-time PCR法檢測SATB1表達變化對L

4、X-2細胞增殖能力及cyclin D1、cyclin E1的影響。Transwell細胞遷移小室及細胞粘附實驗檢測SATB1表達變化對LX-2細胞遷移和粘附能力的影響。Real-time PCR和Western blot法初步篩選SATB1可能影響的細胞信號通路，包括：TGF-β1信號通路（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7）、MAPK信號通路（Ras、Raf-1、MEK、ERK、JNK、P38）以及轉錄因子（

5、Smad4和Ets-1）。利用信號通路抑制劑Manumycin A（Ras）、GW5074（Raf-1）、U0126和PD98059（MEK/ERK）以及Ets-1 siRNA處理LX-2細胞(NC和siSATB1-1)，進一步驗證SATB1調控CTGF的信號通路。Real-time PCR法檢測Ras GTP酶激活蛋白表達變化，篩選SATB1調控Ras激活的基因。硫代乙酰胺法建立肝纖維化大鼠模型，造模5周后將SATB1重組腺病毒經尾靜

6、脈導入大鼠體內，造模7周后HE、Masson及Sirius Red染色觀察肝組織病理改變及膠原沉積，測定肝功能（ALT和AST）評估肝損傷程度，測定羥輔氨酸評估肝內膠原含量變化；免疫組化、real-time PCR及Western blot法檢測α-SMA、CTGF、COL1A1的表達定位及含量變化。
　　【結果】
　　SATB1在肝星狀細胞中表達并定位于細胞核；在肝星狀細胞體內及體外活化過程中，隨著肝星狀細胞活化程度的增加

7、，其表達下降（p<0.05）。抑制SATB1表達可上調HSCs活化相關基因α-SMA、CTGF、COL1A1（p<0.05），促進LX-2細胞增殖并上調cyclinE1，以及促進LX-2細胞遷移（p<0.05）。反之，增強SATB1表達則發(fā)揮與上述相反的作用（p<0.05）。SATB1表達變化對LX-2細胞粘附能力無明顯影響（p>0.05）。抑制SATB1表達，對TGF-β1信號通路中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4及S

8、mad7的mRNA水平，以及Smad3磷酸化和Smad4核轉位無明顯影響；但可激活Ras，繼而誘導Raf-1向胞膜聚集，提高MEK、ERK以及 Ets-1磷酸化水平。反之，增強 SATB1表達則顯著抑制Ras/Raf/MEK/ERK/Ets-1信號通路。此外，用Ras、Raf-1、MEK、ERK通路蛋白抑制劑和Ets-1 siRNA處理LX-2-siSATB1-1細胞，可有效抑制過度激活的Ras、Raf-1、MEK、ERK、Ets-1，

9、從而減弱或消除由SATB1下調所引起的CTGF表達上調。在動物實驗中，與PBS組和AdGFP導入組相比，AdSATB1導入組大鼠肝組織中纖維間隔及匯管區(qū)內膠原沉積明顯減少，羥輔氨酸含量降低，肝功能有所改善，α-SMA、CTGF和COL1A1的表達水平不同程度下降（p<0.05）。
　　【結論】
　　在活化的肝星狀細胞中，SATB1表達水平下降； SATB1下調后激活Ras/Raf/MEK/EKR/Ets-1信號通路，誘導促纖