布魯氏菌外膜蛋白Omp39和Omp14的原核表達及其免疫原性鑒定.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由細胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性布魯氏菌引起的一種人畜共患病。臨床上以發(fā)熱，流產(chǎn)為主要癥狀，嚴重威脅著人畜健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計表明，全世界每年出現(xiàn)50萬例人布魯氏菌病，每年因布魯氏菌病造成的經(jīng)濟損失近30億美元。 在布魯氏菌病控制過程中，檢疫淘汰是一項重要措施。檢疫淘汰的前提就是準確的診斷，但目前常用的布魯氏菌病血清學診斷方法不能區(qū)分是疫苗免疫還是自然感染后引起的血清學反應。尋找合適的布魯氏菌診

2、斷性抗原和研制具有標記性的疫苗一直是人們追求的目標。 布魯氏菌外膜蛋白位于細菌細胞膜的最外層，因其具有免疫原性和免疫保護作用一直備受注目。本試驗從GenBank中下載編碼布魯氏菌外膜蛋白的基因，用BLAST分析后選取與布魯氏菌豬、牛、羊這三種生物型基因序列的同源性高又與其他革蘭氏陰性細菌沒有交叉反應的基因；同時對目的基因編碼的蛋白用TMHMM和ConPredⅡ軟件進行跨膜結構和親水性的分析后，選取沒有跨膜結構且親水性較好的蛋白進

3、行研究。本試驗依據(jù)以上條件選取了羊布魯氏菌16M的外膜蛋白Omp39和Ompl4進行初步研究。 通過Premier 5.0設計引物用于擴增選定的兩個目的基因，以滅活的16M布魯氏茵基因組為模板用降落PCR擴增目的片段。將限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI雙酶切的目的片段直接與同樣雙酶切的表達載體pGEX-4T-2連接，之后將重組表達載體轉化到大腸桿菌BL2l。提取的重組質粒經(jīng)菌液PCR鑒定、重組載體雙酶切鑒定和測序分析確定目的基

4、因成功插入到了表達載體中。然后將含有重組表達載體的菌株在不同溫度、不同時間、不同IPTG濃度下誘導目的蛋白表達，SDS-PAGE電泳檢測結果顯示目的蛋白在大腸桿菌中獲得了大量表達。表達蛋白通過Western-blotting分析發(fā)現(xiàn)能夠與布魯氏菌病豚鼠陽性動物血清發(fā)生較強烈的反應。之后用電洗脫的方法純化了目的蛋白，并將其作為包被抗原，用牛布魯氏菌陽性血清為一抗，兔抗牛IgG為二抗優(yōu)化ELISA檢測條件，試圖進一步探索目的蛋白作為診斷性蛋