活細(xì)胞內(nèi)篩選地塞米松衍生物作用靶蛋白的研究.pdf

1、第一部分糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合域誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 目的:構(gòu)建糖皮質(zhì)激素受體α配體結(jié)合域(GRα-LBD)的誘餌表達(dá)載體，為小分子配體酵母三雜交系統(tǒng)的建立奠定基礎(chǔ)。 方法 RT-PCR擴(kuò)增K562細(xì)胞的GRα-LBD，克隆入誘餌載體pGBKT7中，測(cè)序正確后，再把構(gòu)建好的誘餌載體pGBKT7-GRα-LBD轉(zhuǎn)化到酵母AH109細(xì)胞中，提取酵母蛋白，并用Western blot分析誘餌蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)檢測(cè)誘餌蛋白的毒

2、性、滲漏和自激活作用。 結(jié)果:成功擴(kuò)增了GRα-LBD，并分別成功克隆到pGBKT7中，測(cè)序結(jié)果正確。誘餌載體成功轉(zhuǎn)化到酵母AH109細(xì)胞中，無(wú)毒性、滲漏和自激活作用，Western blot分析也證實(shí)了酵母細(xì)胞表達(dá)誘餌蛋白。 結(jié)論:成功構(gòu)建了GRα-LBD酵母誘餌表達(dá)載體，為建立小分子配體酵母三雜交系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。 第二部分人K562細(xì)胞cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增、純化、鑒定和酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化 目的:對(duì)預(yù)轉(zhuǎn)化到大腸

3、DH5α中的人K562細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，純化和鑒定并將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母為下一步的靶蛋白的篩選做準(zhǔn)備。 方法:對(duì)K562細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，提取文庫(kù)質(zhì)粒，將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母Y187細(xì)胞，并用PCR和酶切鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果。 結(jié)果:成功的擴(kuò)增人K562細(xì)胞cDNA文庫(kù)，并驗(yàn)證了文庫(kù)的多樣性，將文庫(kù)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化酵母Y187細(xì)胞。 結(jié)論: K562細(xì)胞cDNA文庫(kù)的成功擴(kuò)增，純化，鑒定，為進(jìn)一步的文庫(kù)篩選奠定了基

4、礎(chǔ)。 第三部分酵母三雜交技術(shù)篩選地塞米松衍生物作用的靶蛋白 目的:通過(guò)酵母三雜交技術(shù)在人K562細(xì)胞cDNA中篩選地塞米松衍生物作用的靶蛋白。 方法:通過(guò)將轉(zhuǎn)化有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GRα-LBD的酵母AH109細(xì)胞、轉(zhuǎn)化有文庫(kù)質(zhì)粒的酵母Y187細(xì)胞和終濃度為0.4μg/ml的地塞米松衍生物三種物質(zhì)放到一起交配后，將交配后的細(xì)胞鋪于SD/-Trp/-Leu/-His的缺陷培養(yǎng)基上，然后將SD/-Trp/-Leu/-

5、His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的克隆挑取到SD/Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal的缺陷培養(yǎng)基上進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選，重復(fù)挑取三次后仍為藍(lán)色的克隆可能是陽(yáng)性克隆，然后提取酵母質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取大腸桿菌DH5α中的質(zhì)粒，并通過(guò)對(duì)所提取的所有文庫(kù)質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增和對(duì)PCR產(chǎn)物的單酶切分析，將文庫(kù)質(zhì)粒歸類，歸類后從每一類中隨機(jī)選擇一個(gè)代表，通過(guò)酵母回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。酵母回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)

6、果的比對(duì)和進(jìn)一步的分析來(lái)確定所篩選到的靶蛋白的特征。 結(jié)果:共測(cè)序43個(gè)，其中有6個(gè)是重復(fù)的，實(shí)際上我們共篩選到37個(gè)不同的蛋白，經(jīng)過(guò)回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證明20個(gè)是陽(yáng)性克隆，其中一個(gè)是新蛋白。從中選擇6個(gè)進(jìn)行一對(duì)一的酵母交配實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)DDX28和RanBP9/RanBPM是與地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白。 結(jié)論:本研究我們篩選到了2個(gè)與地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白，分別是DDX28和RanBP9/RanBPM。這將為地