中華絨螯蟹蛻皮抑制激素單抗的制備及其在眼柄視上神經(jīng)節(jié)中的表達特征.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)，俗稱河蟹，屬于節(jié)肢動物門，甲殼綱，十足目，是我國五大經(jīng)濟蟹類之一。對甲殼動物來說，只有通過不斷的蛻皮才能完成其生長發(fā)育，而蛻皮是一個非常復(fù)雜的生理過程，不僅受到神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，而且也受到內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響。中華絨螯蟹蛻皮抑制激素(molt inhibiting hormone，MIH)屬于神經(jīng)多肽類激素，在甲殼動物蛻皮過程中發(fā)揮著重要的作用，與蛻皮激素(molt hormone，MH)共

2、同調(diào)節(jié)其蛻皮過程。研究MIH不但可以更深入了解它對蛻皮機制的影響，并且可以對生產(chǎn)實踐提出理論性的指導(dǎo)。
　　本實驗利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了MIH原核表達載體，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了大量表達。通過對大量表達的菌體進行超聲破碎，并分別純化離心后的上清和包涵體沉淀，發(fā)現(xiàn)原核表達的MIH重組蛋白以包涵體形式存在；用8M尿素溶解包涵體，并利用鎳柱親和層析法進行純化，然后用該蛋白進行小鼠免疫，免疫完成后應(yīng)用間接ELISA法檢

3、測抗血清效價達到1:10000以上，說明該免疫的小鼠適合用于細胞融合實驗。
　　細胞融合實驗中，應(yīng)用間接ELISA方法進行陽性雜交瘤細胞檢測，共檢測到13個陽性孔，其中6個強陽性孔；利用有限稀釋法進行亞克隆，通過3次亞克隆最終篩選到1株穩(wěn)定分泌抗體的單克隆雜交瘤細胞株，間接ELISA法檢測效價達到了1:51200；用該株細胞誘生小鼠腹水大量制備單克隆抗體，得到的單克隆抗體效價達到了1:102400，濃度為2.8 mg/mL。Wes