MiR-200a-ZEB2調(diào)控肝癌干性樣細胞惡性表型轉(zhuǎn)化的機制研究.pdf

1、背景：
　　肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，盡管通過手術(shù)切除和肝臟移植可以提高患者生存率，但仍然由于侵襲和轉(zhuǎn)移而高復發(fā)。腫瘤干細胞(Cancer Stem Cells,CSCs)在腫瘤形成和進展中起到重要作用,該細胞具有自我更新的能力。邊緣群細胞（side population,SP），從多數(shù)腫瘤細胞系中分離出來均具有干細胞特性及表型。研究證實，SP細胞是理想的腫瘤干細胞研究的模型。MicroRNAs是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的非編碼小RNA

2、，在多數(shù)腫瘤中充當抑癌基因。最新研究表明，MiR-200家族不但參與調(diào)控細胞的分化、增殖、凋亡等一系列的生命活動過程，而且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。MiR-200a可通過與ZEB基因非編碼區(qū)3’端結(jié)合調(diào)控其表達。而ZEB可與E-鈣粘蛋白基因啟動子結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄。本研究擬通過肝癌干細胞研究miR-200a，揭示肝癌的發(fā)生發(fā)展，為肝癌的防治提供新思路和新靶點。
　　目的：
　　目前microRNAs的研究主要在常規(guī)腫瘤細胞中研究

3、，在對于腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、復發(fā)過程中作用更重要的肝癌干性樣細胞中研究miR-200a/ZEB通路，將對干預肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移、復發(fā)更有意義。
　　方法：
　　1、邊緣群細胞分選：選擇肝癌細胞系高、低侵襲性的MHCC-97H和Huh7細胞經(jīng)hoechst33342染色和（或）verapamil阻斷后，用FACS-III流式細胞分選儀紫外激光激發(fā)識別，分選出肝癌SP細胞和非SP細胞。檢測SP細胞和非SP細胞干性標志物ALBU、KRT

4、14表達水平，確認分選出的亞群細胞即為SP細胞。
　　2、干預miR-200a的表達對SP和非SP細胞生物學特性及EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)的影響：檢測miR-200a及下游分子ZEB的表達情況，驗證活化效果。通過免疫組織化學、PCR技術(shù)、western-blot蛋白檢測技術(shù)檢測EMT標志分子E-cadherin、vimentin、N-cadherin的表達變化。
　　3、干

5、預ZEB表達拮抗miR-200a干預的影響:SP和非SP亞群細胞中同時干預miR-200a和ZEB的表達水平，檢測干預ZEB是否可拮抗miR-200a干預后對SP細胞惡性表型的影響。
　　4、MiR-200a/ZEB通路干預前后對SP細胞體內(nèi)成瘤的影響：(1)成瘤大?。?2)成瘤時間；(3)轉(zhuǎn)移灶的情況；(4)E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達。
　　結(jié)果：
　　1、miR-200a在肝癌

6、細胞系和肝癌組織中為低表達，并根據(jù)肝癌患者臨床病理的統(tǒng)計分析，miR-200a與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)；
　　2、通過流式細胞儀成功分選出SP細胞；
　　3、miR-200a在SP細胞中表達低于其他亞群；
　　4、調(diào)控SP細胞中miR-200a的表達后，SP細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力發(fā)生變化：體內(nèi)及體外實驗證實；
　　5、調(diào)控miR-200a后，ZEB2發(fā)生明顯變化，恢復ZEB2表達后，可以逆轉(zhuǎn)miR-200a引起的侵襲轉(zhuǎn)移