RNA干擾原癌基因c-Met對鼻咽癌作用的影響及其機制研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：檢測原癌基因c-Met在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義，探討其在鼻咽癌侵襲轉移過程中的作用。
　　 方法：采用免疫組織化學SP 法和RT-PCR分別檢測31例鼻咽癌及10例慢性鼻咽炎性組織中c-Met 蛋白及c-Met mRNA的表達水平，并聯(lián)系其臨床病理資料。
　　 結果：c-Met 蛋白在鼻咽癌活檢組織中的陽性表達率明顯高于鼻咽炎性組織，差異有極顯著性。C-Met的表達與鼻咽癌的臨床分期

2、、伴有淋巴結轉移相關；與年齡、性別、組織分型均無相關。C-Met mRNA在鼻咽癌活檢組織中的表達水平明顯高于鼻咽炎性組織，差異有顯著性。
　　 結論：鼻咽癌組織中c-Met 蛋白及mRNA 水平均存在高表達，c-Met的高表達與其侵襲和轉移有密切的關系，c-Met 可作為鼻咽癌臨床治療及預后的參考指標。
　　 第二部分：
　　 目的：設計以人c-Met基因為靶向的shRNA，構建攜帶此shRNA的重組質粒，檢測

3、其抑制c-Met表達的效應，篩選RNA 干擾作用最強的shRNA 片段。
　　 方法：針對c-Met基因的mRNA 序列設計3個干擾靶點，分別構建3個shRNA 質粒表達載體和1個隨機序列質粒表達載體，經(jīng)大腸桿菌擴增，酶切、PCR、測序鑒定，用脂質體介導的方法將其轉染至鼻咽癌CNE-2細胞中，采用real-time PCR和westernblot 檢測c-Met基因在mRNA和蛋白表達情況，比較轉染前后其表達差異，判斷各shRN

4、A的干擾效應。
　　 結果：經(jīng)測序證實，成功構建pGP-silencer-U6/Neo/GFP/c-Met 真核表達質粒。重組質粒轉染CNE-2細胞后，c-Met基因的mRNA 水平及蛋白水平明顯下調，其中以2 號重組質粒效應最強，mRNA 水平下調90％，蛋白水平下調75％。
　　 結論：成功構建了針對c-Met基因的RNAi 重組質粒，為下一步研究c-Met基因對鼻咽癌CNE-2細胞生物學行為的功能奠定了基礎.

5、>　　 第三部分：
　　 目的：探討c-Met shRNA 真核表達載體對人鼻咽癌CNE-2細胞增殖、侵襲、轉移及凋亡作用的影響。
　　 方法：建立轉染pGP-silencer-U6/Neo/GFP/c-Met 真核表達質粒和隨機序列對照質粒的穩(wěn)定單克隆細胞，分別采用CCK-8、基質膠粘附實驗、體外遷移實驗、transwell 體外侵襲實驗、流式細胞儀檢測轉染前后細胞增殖能力、細胞粘附率、細胞運動能力、細胞侵襲能力及細

6、胞凋亡率的變化。
　　 結果：c-Met表達下調后，CNE-2細胞的增殖能力、細胞對基質膠的粘附率明顯降低，CNE-2細胞的體外遷移能力、侵襲能力明顯降低，CNE-2細胞凋亡率增加。
　　 結論：原癌基因c-Met 明顯地促進了鼻咽癌CNE-2細胞株的體外增殖、粘附、遷移和侵襲能力，抑制了鼻咽癌CNE-2細胞的凋亡。提示c-Met在鼻咽癌的惡性進展中起重要作用，是一個潛在的鼻咽癌治療靶點。
　　 第四部分：

7、>　　 目的：探討c-Met shRNA 真核表達載體對人鼻咽癌CNE-2細胞裸鼠移植瘤生長的影響。
　　 方法：建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，觀察c-Met shRNA 真核表達載體的抗瘤療效，分別在CNE-2細胞形成的移植瘤的體部和基底部多點微量注射c-Met shRNA 真核表達載體質粒，注射等體積的隨機質粒載體和生理鹽水作為對照組，記錄腫瘤體積的增長曲線，并在4周后處死裸鼠，取出移植瘤，用Western Blot 及TUN

8、EL分別檢測移植瘤中原癌基因c-Met 蛋白的表達水平和腫瘤細胞原位凋亡率。
　　 結果：36只裸鼠無一死亡，體重均勻增加，成瘤率100％。在注射組中，c-Met shRNA真核表達載體組的腫瘤體積的增長均比相應的注射隨機質粒載體和生理鹽水組要慢。取出的移植瘤中c-Met 蛋白的表達和原位TUNEL 檢測結果提示：移植瘤中相對于生理鹽水對照組和隨機質粒對照組，c-Met shRNA 真核表達載組c-Met 蛋白表達明顯下降；移植