STY39對人肺Ⅱ型上皮細胞系A549表達炎癥因子的調節(jié)作用.pdf

1、α-黑素細胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)是一種內源性小分子神經內分泌免疫調節(jié)肽，其能促進黑色素形成，有明顯的退熱、抗炎和免疫調節(jié)作用。α-MSH的抗炎和免疫調節(jié)作用一直是神經內分泌免疫調節(jié)研究領域的熱點之一。α-MSH對一部分早期炎癥因子有明顯的抑制作用，國外和我們以往的研究均顯示，α-MSH對實驗性致死性內毒素血癥、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorydist

2、ress syndrome，ARDS)有顯著的保護作用。我們前面的研究還顯示其對晚期炎癥因子也有很好的抑制作用。α-MSH的受體為黑素皮質受體(melanocyte receptor)，有五種亞型，分別命名為MC1～5R，均屬于Ⅰ型G蛋白耦聯受體家族，具有七次跨膜結構。α-MSH通過結合黑皮質素受體(MC1R，MC3R，MC4R和MC5R)來發(fā)揮作用，MC1R和MC5R主要介導其抗炎和免疫調節(jié)作用，MC3R和MC4R主要參與α-MSH對

3、飲食、體重以及能量代謝平衡的調節(jié)。但是α-MSH作為抗炎免疫調節(jié)劑，本身存在缺點，其對MC1R和MC3R選擇性較高，對MC4R和MC5R親和力很低。雖然目前[Nle4,D-Phe7]α-MSH(NDP-MSH)是較為理想的α-MSH抗炎類似物之一，具有高效、作用持續(xù)時間長、蛋白水解酶抵抗性強、穩(wěn)定性高、可溶性好等優(yōu)點，已用于Ⅰ期臨床試驗，但是NDP-MSH對受體選擇性不高，對其他生理功能可能會產生影響，對MC1R的高親和力導致其有明顯的

4、色素沉著作用。本教研室自主研制了新型α-MSH類似物(專利授權號ZL200510026927.3，命名：STY39)，前期研究已經證明其具有MC1R和MC5R選擇性，STY39在更好地發(fā)揮抗炎和免疫調節(jié)作用的同時盡量減輕其副作用。
　　 國外和我們以往關于α-MSH和STY39的抗炎作用和機制的研究對象主要集中在血液中的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞以及樹突狀細胞等免疫細胞上。我們以往的研究顯示，STY39對實驗性致死性內毒素血

5、癥、失血性休克加LPS二次打擊導致的急性肺損傷(acute lung iniury，ALI)有顯著的保護作用，但STY39對于ALI時肺部的實質細胞如肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell，AEC)尤其是Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell typeⅡ，AECⅡ或ATⅡ)的抗炎和免疫調節(jié)作用及其相關機制方面的研究則未涉及。ALI是指機體遭受嚴重感染、創(chuàng)傷、休克等打擊后，出現的以彌漫性

6、肺泡毛細血管膜損傷導致的肺水腫和微肺不張為病理特征的一種肺部炎癥和通透性增加綜合征，ARDS是一種嚴重的ALI。ALI后真正的臨床治療難點是炎癥消退后的肺纖維化。AEC是肺組織的結構細胞，其中ATⅡ是肺的重要結構細胞，具有干細胞的性質及分泌表面活性物質維持肺泡表面張力，增殖分化成肺泡Ⅰ型上皮細胞，修復肺損傷等能力，對維持肺泡的正常結構和功能有重要意義。ATⅡ細胞雖不屬于“傳統(tǒng)”意義上的免疫細胞，但因其在各種生理及病理條件下能表達主要組織

7、相容性復合物(MHC)Ⅱ類分子，分泌多種細胞因子、炎癥介質，參與炎癥細胞的相互作用，故被看作為一類重要的免疫調節(jié)細胞，起到肺部免疫調節(jié)和防御的作用。在炎癥過程中，受炎癥因子的刺激，ATⅡ亦能分泌產生多種炎癥因子，在ALI和ARDS以及肺纖維化進展中發(fā)揮重要作用。因此，研究STY39對炎癥狀態(tài)下的ATⅡ是否有抗炎和免疫調節(jié)作用及其相關信號轉導途徑對深入了解和闡明ALI和ARDS以及肺纖維化這些疾病的發(fā)展和轉歸都有深刻的意義。我們選取人肺Ⅱ

8、型上皮細胞系A549(即人肺腺癌細胞系)為研究對象，從肺上皮細胞的角度進一步揭示STY39抗炎和免疫調節(jié)作用及其相關機制，為后續(xù)STY39進入臨床應用奠定基礎。
　　 第一部分 STY39對LPS誘導人肺Ⅱ型上皮細胞系A549表達炎癥因子的調節(jié)作用
　　 目的：觀察STY39對LPS誘導A549細胞表達的炎癥因子是否有調節(jié)作用。
　　 方法：利用體外培養(yǎng)的A549細胞作為研究對象，按照對照組、LPS刺激組、STY

9、39(10-6mol/L、10-8mol/L、10-10 mol/L、10-12mol/L)組、α-MSH(10-6mol/L、10-8mol/L、10-10 mol/L、10-12 mol/L)組分組，作用不同時間點，通過實時熒光定量RT-PCR法和ELISA法檢測早期炎癥因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA和蛋白表達水平；通過實時熒光定量RT-PCR法和Western Blot法檢測晚期炎癥因子高遷移率

10、族蛋白B1(high mobility group-box1，HMGB1)的mRNA和蛋白表達水平；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中胞外分泌的HMGB1；以人單核細胞系U937進行細胞黏附實驗，檢測A549細胞對U973細胞的黏附能力；實時熒光定量RT-PCR法以及FACS檢測黏附分子ICAM-1的mRNA和蛋白表達水平； ELISA法檢測A549細胞產生肺表面活性蛋白-D(surfactant protein-D，SP-D)的水平。結果

11、：本研究發(fā)現STY39可顯著降低A549細胞經LPS誘導后分泌的早期炎癥介質IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的蛋白和mRNA水平的表達，增強IL-4的表達。LPS可刺激A549細胞釋放HMGB1，但其mRNA表達水平的改變較其蛋白表達水平的改變滯后很多。STY39可降低A549細胞細胞核內HMGB1蛋白表達以及胞外分泌水平，對HMGB1mRNA的表達也有一定抑制作用。STY39可減少A549細胞對U937細胞的黏附，并能顯著抑

12、制A549細胞表達ICAM-1。SP-D是ATⅡ和氣道Clara細胞合成并分泌的一類蛋白，是肺部重要的天然免疫防御分子，A549細胞自分泌高水平的SP-D，STY39可促進SP-D的分泌。結論：STY39能顯著下調LPS誘導的早期和晚期炎癥細胞因子的產生，促進IL-4和SP-D的分泌，與α-MSH相比，STY39抑制炎癥和免疫調節(jié)的作用更強。
　　 第二部分 STY39抑制人肺Ⅱ型上皮細胞系A549表達炎癥因子的相關分子機制

13、r>　　 目的：探討STY39抑制A549產生炎癥因子的相關信號轉導通路。方法：體外培養(yǎng)A549細胞，按照對照組、LPS刺激組、STY39(10-8mol/L)組、α-MSH(10-8mol/L)組分組，半定量RT-PCR檢測A549細胞上MC1R、MC2R、MC3R、MC4R、MC5R受體的組成性表達分布情況，實時熒光定量RT-PCR檢測其受LPS刺激后和分別加入不同濃度的STY39和α-MSH處理后MC1～MC5R的mRNA表達變

14、化情況；通過Westren Blot檢測各組磷酸化Erk、磷酸化JNK、磷酸化P38、NF-κB p65和IκBα的蛋白水平表達情況；雙熒光報告基因法檢測STY39對LPS誘導的A549細胞內NF-κB轉錄水平變化的影響。結果：對A549細胞表面MC1R～MC5R表達的初步研究發(fā)現，A549細胞組成性表達MC1R～MC5R，以MC1R表達最高，MC5R次之，MC2R～MC4R表達較弱；LPS刺激后，發(fā)現MC5R的mRNA表達水平顯著升高

15、，MC1R其次，其他三型受體mRNA水平變化不明顯；Western Blot結果顯示，STY39作用A549細胞后部分抑制磷酸化Erk、磷酸化JNK、磷酸化P38、NF-κB p65的活化，抑制胞漿內IκBα的降解，比α-MSH的抑制作用更強；雙熒光報告基因法實驗結果顯示，STY39明顯抑制胞內NF-κB的轉錄活性。結論：STY39可能通過A549細胞表達的MCRs經MAPKs信號轉導途徑、NF-κB信號轉導途徑部分抑制LPS誘導的A5