組織因子靶向性納米粒介導siRNA靶向遞送的研究.pdf

1、組織因子（TF）作為凝血途徑的始動因子以為人所熟知。在血管損傷后，TF和凝血因子VIIa（FVIIa）形成復合物激活凝血蛋白酶的瀑布反應，導致纖維蛋白沉積和血小板的活化。另外，在許多疾病如敗血癥，動脈粥樣硬化和腫瘤，血管中TF的異常表達會引起致命的血栓形成。近年來研究表明，血管中的TF在產(chǎn)生凝血蛋白酶和后續(xù)激活蛋白酶激活受體(PARS)中也發(fā)揮著非止血作用。這些TF依賴性的信號通路促進了一系列生物進程，包括炎癥，腫瘤轉移和細胞遷移。本課

2、題組前期研究的EGFP-EGF1蛋白具有TF特異性和高度的親和力，且將其連接于聚乙二醇-聚乳酸-聚羥基乙酸納米粒（PLGA）納米粒表面后構建的EGFP-EGF1-PLGA納米粒也具有TF靶向性。
　　小干擾RNAs（siRNA）通過完全互補的RNA誘導沉默復合體(RISC)介導特異性切割，并有針對性的破壞靶基因的mRNA，從而產(chǎn)生靶基因的mRNA序列特異基因沉默效應。它們已被證明能有效下調人類細胞中的基因表達，從而具有治療疾病的潛

3、力。然而，siRNA分子本身帶負電荷，易于被血清中的核酸酶降解，容易被腎臟清除，并無靶向分布能力，這些都導致它難以到達作用的靶細胞。它的應用受到如穩(wěn)定性差，半衰期短，和沉默效率低等許多限制。因此，siRNA作為RNA干擾（RNAi）的一種手段，其治療最為主要的障礙是缺乏有效的遞送系統(tǒng)。病毒遞送系統(tǒng)如慢病毒、腺病毒，可有較高的轉染效率，但由于其致突變性，載藥量有限，以及引起炎癥反應和免疫應答等安全隱患而受到限制。因此，直接的系統(tǒng)性的非病毒

4、載體是siRNA的最佳選擇，該載體應具有運載核酸類分子如基因，siRNAs，或反義RNA等進入細胞的能力。非病毒遞送系統(tǒng)包括siRNA的化學修飾，脂質體，納米粒，多肽和靶向遞送。隨著合成材料和納米技術的發(fā)展，可以合成具有特殊功能的納米材料。其在生物學領域的應用變得普遍。納米材料因其具有低毒性，良好的生物降解性和生物相容性，而被用作轉染載體，如殼聚糖，聚乙烯亞胺（PEI），聚乳酸-聚羥基乙酸（PLGA），磁性納米粒和納米碳管等。因為可以抵

5、抗高核酸酶并具有粘膜粘附特性，使得它們成為siRNA重要的載體。靶向 RNAi治療是一個相對新的研究領域，它可以滿足體內遞送要求的選擇靶向性。靶向病變細胞，器官或組織可以提高一定siRNA劑量下的基因沉默效率。特異性的細胞靶向功能還可以抑制siRNA對非病變細胞造成的副作用。通過具有高度特異性和親和力的抗體，短肽和其他配體連接于載體表面可以介導siRNA到達靶向組織和細胞。
　　前期研究采用復乳法制備的EGFP-EGF1-PLGA

6、納米粒，適合包載水溶性的基因藥物。它不僅對包載的藥物具有保護作用，還可將其靶向遞送至病變組織或細胞。鑒于上述基礎，本研究將利用該納米粒作siRNA或shRNA的載體，靶向遞送至病變細胞，發(fā)揮基因沉默效應。由于前期的研究都是基于大鼠模型的疾病進行，而有些疾病模型在小鼠中更為經(jīng)典，為了拓寬該納米粒的應用范圍，本研究還驗證了ENP在小鼠高表達TF的疾病模型（動脈粥樣硬化模型）中的靶向性。
　　第一部分 載組織因子siRNA的EGFP-E

7、GF1蛋白結合聚乙二醇－聚乳酸－聚羥基乙酸納米粒的構建及表征
　　目的:篩選出有效的大鼠組織因子特異性的siRNA片段(TF-siRNA)；將該片段載入EGFP-EGF1蛋白結合聚乙二醇－聚乳酸－聚羥基乙酸納米粒（PEG-PLGA）中，并對該納米粒的性質進行鑒定。
　　方法:選擇大鼠膠質瘤細胞系C6來篩選siRNA片段，細胞表面天然表達TF，通過傳統(tǒng)轉染試劑lipo2000轉染細胞，進行實時定量PCR（Q-PCR）和west

8、ern-blot檢測細胞組織因子的mRNA和蛋白水平改變，進而篩選出最佳的TF-siRNA片段。
　　采用復乳法，合成出包載TF-siRNA的PLGA納米粒（TF-siRNA-NP），之后將EGFP-EGF1蛋白巰基化，連接于TF-siRNA-NP表面，合成出TF-siRNA-ENP。通過粒徑/Zeta電位測定儀對納米粒的粒徑和 Zeta電位進行測定。通過普通電鏡觀察納米粒的形態(tài)，并通過免疫電鏡觀察納米粒表面連接的蛋白。提取納米粒

9、中的siRNA計算siRNA的載藥量和包封率。通過體外釋放實驗計算出siRNA的釋放量。
　　結果:siRNA-638片段為大鼠組織因子最佳沉默片段。載入TF-siRNA的ENP（TF-siRNA-ENP）粒徑大小約100nm左右，外觀大小均一、圓整。Zeta電位為-11mV左右。免疫電鏡結果證實納米粒表面連接有EGFP-EGF1蛋白。TF-siRNA的包封率約81.33％。體外不同pH環(huán)境中siRNA的釋放無明顯差異，6小時內快

10、速釋放約42％。
　　結論:TF-siRNA-ENP粒徑大小，EGFP-EGF1蛋白的成功連接，siRNA的載藥量和體外的快速釋放都可滿足后續(xù)實驗需求。
　　第二部分 載組織因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白結合聚乙二醇－聚乳酸－聚羥基乙酸納米粒的靶向性及體外評價
　　目的:驗證TF-siRNA-ENP對損傷的腦微血管內皮細胞（BMECs）的靶向性。評價TF-siRNA-ENP對腫瘤壞死因子α（TNFα）誘導的BM

11、ECs損傷過程中，組織因子表達和組織因子活性的抑制效果。評價該納米粒的細胞毒性。
　　方法:兩次消化加Percoll梯度離心法提取大鼠BMECs，TNFα誘導BMECs的損傷，建立損傷的微血管內皮細胞模型。在ENP納米粒表面連接香豆素-6示蹤納米粒，測定其載藥量等性質，并進行細胞攝取實驗；同時用對siRNA進行標記，在BMECs中示蹤siRNA。轉染TF-siRNA-ENP進入誘導的BMECs，通過實時定量PCR，western-

12、blot，和流式檢測TF表達水平的改變。并通過TF活性檢測評價其對細胞TF活性的影響。CCK-8法檢測納米粒的細胞毒性。
　　結果:TNFα誘導損傷的BMECs可以高表達TF。TF-siRNA-ENP可以更好的被損傷BMECs攝取，介導siRNA進入細胞內。有效下調損傷過程中細胞TF mRNA和蛋白的表達水平。并能有效降低細胞TF的活性。在有效作用劑量下TF-siRNA-ENP對細胞活性無影響，較lipo2000明顯優(yōu)勢。

13、　　結論:TF-siRNA-ENP是TF-siRNA靶向遞送至損傷內皮細胞的一個有效遞送系統(tǒng)。它的細胞安全性好，基因沉默效率高。
　　第三部分 EGFP-EGF1蛋白結合聚乙二醇－聚乳酸－聚羥基乙酸納米粒在動脈粥樣硬化模型中靶向性的研究
　　目的:驗證EGFP-EGF1-PLGA納米粒（ENP）對小鼠動脈粥樣硬化模型（AS模型）的靶向性。
　　方法:通過復乳法，分別構建載香豆素-6和Dir的ENP納米粒。分別測定他們的

14、載藥量。用單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)誘導原代小鼠主動脈平滑肌細胞（VSMCs），用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)誘導小鼠單核巨噬細胞（Raw264.7）分別構建體外高表達TF的動脈粥樣硬化細胞模型。高脂伺料持續(xù)14周喂養(yǎng)ApoE基因敲除小鼠（ApoE-/-），建立小鼠動脈粥樣硬化模型。細胞攝取載香豆素-6納米粒的實驗，通過熒光顯微鏡和流式細胞學檢測細胞內的熒光強度，判斷其細胞靶向性。通過油紅O染色和血清膽固醇脂的測定來驗證AS動

15、物模型中粥樣硬化斑塊的形成。載Dir的納米粒進行器官成像實驗，觀察其體內分布；同時進行冰凍切片，激光共聚焦直接觀察納米粒在病變血管中的分布。
　　結果:兩種細胞經(jīng)過誘導后建立的細胞模型，均可高表達TF。ENP納米?？梢愿玫谋荒Ｐ图毎鶖z取。與不連接EGFP-EGF1蛋白的納米粒之間的差異具有統(tǒng)計學意義。高脂飲食喂養(yǎng)14周的ApoE-/-小鼠血清膽固醇脂明顯升高，主動脈血管切片中可見內膜增厚和脂質斑塊的沉積。器官成像結果顯示AS模

16、型中，斑塊區(qū)域可更好的攝取ENP納米粒。切片結果顯示ENP在血管中多分布在高表達TF的部位，并可以部分與斑塊區(qū)域重合。
　　結論:ENP具有小鼠AS模型的靶向性。
　　第四部分 載CCR2-shRNA的EGFP-EGF1蛋白結合聚乙二醇－聚乳酸－聚羥基乙酸納米粒的體外研究
　　目的:在體外驗證載CC趨化因子2特異性shRNA（CCR2-shRNA）的ENP（CCR2-shRNA-ENP）可以有效下調AS細胞模型的CCR

17、2表達，并抑制細胞的遷移能力。
　　方法:通過雙重免疫熒光法和實時定量PCR檢測AS模型小鼠主動脈內CCR2和TF的表達情況。通過實時定量PCR，選擇誘導劑MCP-1和oxLDL最佳的作用濃度及作用時間點，構建體外同時高表達TF和CCR2的AS細胞模型。誘導后的細胞給予CCR2-shRNA-ENP干預，通過實時定量PCR和western-blot測定細胞CCR2表達水平的改變。同時用CCK-8法評價CCR2-shRNA-ENP的細

18、胞毒性。轉染CCR2-shRNA-ENP的細胞，分別進行細胞遷移實驗，評價其對這兩種細胞遷移能力的改變。
　　結果:AS模型小鼠主動脈內高表達TF和CCR2，在14周時兩者表達都處于高位。通過Q-PCR結果選擇MCP-1以10ng/ml作用于VSMCs2h，oxLDL以50μg/ml作用于Raw264.71h，來構建細胞模型。轉染CCR2-shRNA-ENP后的模型細胞CCR2表達在mRNA和蛋白水平都有明顯下降。且不影響細胞活性