超聲輻照SonoVue介導(dǎo)CD-TK基因靶向治療乳腺癌的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌是威脅女性健康的主要疾病之一,發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。由于傳統(tǒng)的治療方法有其自身的局限性,尋找新的療法迫在眉睫。隨著分子生物學(xué)及基因工程的迅速發(fā)展,基因治療已成為惡性腫瘤治療的有效手段之一。自殺基因療法以其獨(dú)特的作用機(jī)制在乳腺癌治療中備受關(guān)注。聯(lián)合應(yīng)用胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)、單純皰疹病毒胸苷激酶/更昔洛韋(HSV-TK/GCV)兩大自殺基因系統(tǒng)可以利用兩系統(tǒng)的互補(bǔ)作用,提高腫瘤

2、殺傷作用,改善治療效果,而且可以擴(kuò)大腫瘤治療譜,減少耐藥現(xiàn)象發(fā)生。
　　 靶向和高效是基因治療的關(guān)鍵和瓶頸問(wèn)題,也是基因治療能否在臨床上得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在。癌組織特異性啟動(dòng)子介導(dǎo)的靶向治療策略的應(yīng)用以及超聲微泡載體的出現(xiàn)為基因治療乳腺癌展現(xiàn)出了一個(gè)全新的應(yīng)用前景。
　　 KDR啟動(dòng)子在增生活躍的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及多數(shù)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)而在正常組織不表達(dá)或表達(dá)甚微。研究表明,其驅(qū)動(dòng)外源性自殺基因,可使自殺基因在腫瘤血管內(nèi)皮

3、細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá),達(dá)到雙重靶向治療的作用,同時(shí)減少對(duì)正常組織的毒副作用。
　　 病毒載體和常用的非病毒載體脂質(zhì)體分別存在高免疫原性及具有毒性、體內(nèi)轉(zhuǎn)染率低的不足,而且缺乏靶向性。目前,超聲在基因和藥物靶向傳輸中的應(yīng)用是正在興起的研究熱點(diǎn)。其核心是應(yīng)用超聲波及聲學(xué)造影劑微氣泡發(fā)展基因和藥物定向傳輸及釋放技術(shù),即超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理是將聲學(xué)造影劑微氣泡耦連或包載靶向基因或藥物,使載基因或藥物微泡在顯影組

4、織的同時(shí),利用聲學(xué)造影劑微氣泡在超聲場(chǎng)內(nèi)發(fā)生的空化效應(yīng),將基因和藥物運(yùn)載和釋放到特定的組織和器官,使局部組織達(dá)到有效的治療濃度。已有充分研究證實(shí)該系統(tǒng)的可行性和應(yīng)用前景,其具有全身給藥少、局部濃度高、無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、并可在床邊進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn),給予當(dāng)前靶向性差、正處于低迷狀態(tài)的基因療法以新的希望。
　　 目的：
　　 1.篩選超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的最適參數(shù)條件,并檢測(cè)它作為基因轉(zhuǎn)移技術(shù)在MCF-7細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染

5、效率,探討該技術(shù)用于MCF-7細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的可行性。
　　 2.采用篩選出的最適超聲輻照微泡參數(shù)轉(zhuǎn)染含有KDR啟動(dòng)子及CD/TK基因的重組質(zhì)粒pEGFP-KDRP-CD/TK于高表達(dá)KDR的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞及不表達(dá)KDR的人結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞,探討KDR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)雙自殺基因CD/TK對(duì)MCF-7細(xì)胞的體外靶向殺傷作用。
　　 方法
　　 1.以不同超聲強(qiáng)度(0.5W/cm2、0.75W/cm2、1W/c

6、m2、1.25W/cm2)及不同超聲輻照時(shí)間(10s、30s、45s、60s)的超聲參數(shù)聯(lián)合一定濃度微泡作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,通過(guò)MTT染色,篩選出對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯抑制的超聲參數(shù)。
　　 2.將MCF-7細(xì)胞分成5組:①裸質(zhì)粒組(NP),②聲諾維微泡組(MV),③超聲組(US),④超聲+聲諾維微泡組(US&MV),⑤脂質(zhì)體組(LP)。用上述不同基因轉(zhuǎn)染方式轉(zhuǎn)染pEGFP-C2質(zhì)粒,通過(guò)觀(guān)察、計(jì)數(shù)表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞,

7、比較各組轉(zhuǎn)染效率。
　　 3.用篩選出的最適超聲微泡參數(shù)轉(zhuǎn)染含有KDR啟動(dòng)子及CD/TK基因的重組質(zhì)粒pEGFP-KDRP-CD/TK于表達(dá)KDR的MCF-7細(xì)胞及不表達(dá)KDR.的LS174T細(xì)胞,通過(guò)綠色熒光蛋白表達(dá)比較基因轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR檢測(cè)目的基因CD/TK的表達(dá)。在前藥5-FC和/或GCV作用下,MTT測(cè)定腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率,觀(guān)察自殺基因的協(xié)同效應(yīng)及旁觀(guān)者效應(yīng)。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞存活率

8、隨著超聲強(qiáng)度的增強(qiáng)及輻照時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,當(dāng)超聲強(qiáng)度為0.75W/cm2、輻照45s和超聲強(qiáng)度1W/cm2、輻照30s時(shí),MCF-7細(xì)胞存活率仍>90％,對(duì)細(xì)胞損傷小,是用于MCF-7細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的最適參數(shù)。
　　 2.五組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,超聲組和微泡組僅見(jiàn)很少的綠色熒光細(xì)胞；而超聲微泡組與脂質(zhì)體組均見(jiàn)大量的綠色熒光細(xì)胞,轉(zhuǎn)染率分別為(23.87±2.74)％和(22.03±2.29)％,兩者比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；超聲

9、微泡組的轉(zhuǎn)染率明顯高于單純超聲組或單純微泡組(P<0.001)。
　　 3.超聲輻照聲諾維微泡介導(dǎo)DEGFP-KDRP-CD/TK基因轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞及LS174T細(xì)胞后,通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察兩種細(xì)胞均被轉(zhuǎn)染,且轉(zhuǎn)染效率相似,分別為(21.92±3.64)％、(20.97±2.74)％,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4.RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染pEGFP-KDRP-CD/TK的MCF-7細(xì)胞內(nèi)有CD/TK目

10、的基因的表達(dá),而LS174T細(xì)胞未檢測(cè)到目的基因的表達(dá)。
　　 5.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞對(duì)前藥具有較高的敏感性,單獨(dú)用前藥5-FC、GCV與聯(lián)合用藥細(xì)胞抑制率分別為(38.16±1.56)％、(37.29±1.95)％及(61.22±0.70)％,聯(lián)合用藥較單獨(dú)用藥差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),且各組細(xì)胞抑制率均顯著高于基因轉(zhuǎn)染率(21.92±3.64)％(P<0.001)；而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的LS174T細(xì)胞對(duì)前藥

11、不敏感,聯(lián)合用藥較單獨(dú)用藥,細(xì)胞抑制率無(wú)顯著差別(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.超聲輻照聲諾維微泡介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的最適超聲參數(shù)為聲強(qiáng)0.75 W/cm2,輻照45s或聲強(qiáng)1 W/cm2,輻照30s。
　　 2.超聲微泡是一種安全、高效、靶向的基因傳遞系統(tǒng)。
　　 3.超聲輻照聲諾維轉(zhuǎn)染pEGFP-KDRP-CD/TK重組質(zhì)粒于MCF-7細(xì)胞和LS174T細(xì)胞,二者均具有較高的轉(zhuǎn)